EFECTO ANTIPARASITARIO DE INHIBIDORES DE CISTEIN PROTEASAS IN VITRO E IN VIVO EN LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EXPERIMENTAL

JUAN C. ENGEL, PATRICIA S. DOYLE, JAMES H. McKERROW

Department of Pathology, University of California and Veterans Administration Medical Center, San Francisco, 94143, USA

Key words: Trypanosoma cruzi, cruzain, cysteine protease inhibitors

Resumen

El mal de Chagas, endémico en la mayoría de los países de América, causa una alta morbilidad y mortalidad. Aunque evidencias experimentales y clínicas muestran la importancia de la quimioterapia tanto en la fase aguda como crónica de la enfermedad, el tratamiento de los pacientes se ve limitado por la toxicidad de las drogas disponibles. En esta revisión se describe el diseño, evolución y selección de péptidos miméticos capaces de interrumpir el ciclo intracelular de T. cruzi y de curar infecciones experimentales agudas en animales de laboratorio. Los péptido-miméticos inhiben específicamente la actividad enzimática de cruzaína, una cisteín proteasa de T. cruzi, y causan alteraciones en el complejo de Golgi y retículo endoplásmico, acumulación de enzima no procesada en cisternas del complejo de Golgi, y disminución de la enzima acumulada en lisosomas. El compuesto más efectivo, N-Pip-F-hF-VSf, cura infecciones letales agudas en animales experimentales. No se observan lesiones miocárdicas, infiltración linfocitaria, o nidos de amastigotes intracelulares en animales tratados con el compuesto. Estudios toxicológicos y farmacoquinéticos preliminares indican la ausencia de toxicidad asociada a altas dosis y tratamientos prolongados. Los inhibidores de proteasas podrían constituir en el futuro buenas alternativas quimioterapéuticas para el tratamiento del Chagas agudo y crónico.

Abstract

Trypanocidal effect of cysteine protease inhibitors in vitro and in vivo in experimental Chagas disease. Endemic in most American countries, Chagas’ disease causes high morbidity and mortality. Recent experimental and clinical evidence shows the importance of chemotherapy in both the acute and chronic phases of this disease. However, treatment is yet limited by the toxicity associated to available drugs. This review describes the design, evolution, and selection of dipeptides that interrupt the intracellular cycle of T. cruzi and cure acute experimental infections in laboratory animals. Peptido-mimetic inhibitors specifically bind cruzain, a T. cruzi cystein protease. The inhibitors cause alterations in the Golgi complex and ER, accumulation of unprocessed enzyme within Golgi cisternae, and decrease of mature cruzain within lysosomes. The most effective compound, N-Pip-F-hF-VSf, cured an acute lethal infection in experimental animals. Myocardial lesions, lymphocyte infiltration and intracellular amastigote clusters were absent in treated animals. Preliminary toxicology and pharmacokinetic analyses suggest the lack of toxicity associated to high doses and prolonged treatment regimes. Protease inhibitors may soon become good chemotherapeutic alternatives for acute and chronic Chagas’ disease.

Dirección postal: Dr. Juan C. Engel, VAMC, San Francisco Tropical Disease Research Unit, 4150 Clement Street, 113B, San Francisco, 94121, USA
Fax: (415)750-6947 E-mail: jcengel@itsa.ucsf.edu

Alrededor de 16-18 millones de personas en América están infectadas con Trypanosoma cruzi y se calcula que más de 90 millones de residentes de zonas endémicas están expuestos a contraer la infección con el parásito1. La enfermedad de Chagas se subdivide en dos fases, aguda y crónica. La fase aguda dura alrededor de 90 días y se caracteriza por la presencia de parásitos circulantes. Aunque la miocarditis aguda causa una alta mortalidad, la mayoría de los pacientes muere durante la fase crónica2, 4. La quimioterapia tradicional con nifurtimox y benznidazol es efectiva en alrededor del 60% de los casos y se restringe en general a la fase aguda debido a su alta toxicidad5, 7. Sin embargo, existen nuevas evidencias experimentales y clínicas que confirman la correlación entre cardiopatía y carga parasitaria en el músculo cardíaco en ambas fases de la enfermedad8, 12. Por ejemplo, el tratamiento de pacientes crónicos con benznidazol trajo una disminución tanto de la cardiopatía como de las alteraciones electrocardiográficas asociadas11. Estos resultados recalcan la importancia de los estudios destinados al desarrollo de nuevas terapéuticas para la enfermedad de Chagas.
Cruzaína (cruzipaína, gp 51/57) es una cisteín proteasa perteneciente a la familia de las catepsinas L. Descripta inicialmente por Cazzulo y colaboradores13, cruzaína es la proteasa más abundante en todos los estadíos de T. cruzi. Varios grupos científicos en distintos países han caracterizado la enzima a nivel bioquímico, molecular e inmunológico13, 21. Nosotros establecimos estrechas colaboraciones tendientes al desarrollo de quimioterapia para la enfermedad de Chagas basada en la síntesis de inhibidores reversibles e irreversibles específicos contra cruzaína. El diseño de péptidos miméticos (CPI) capaces de bloquear específi-camente el sitio activo de la proteasa permitió el desarrollo de inhibidores sumamente efectivos. Los dipéptidos iniciales20 se modificaron a posteriori con el propósito de aumentar su afinidad por el sitio catalítico de la enzima y vida media in vivo, incrementar la solubilidad en soluciones acuosas y por ende posibilitar su uso en regímenes orales de tratamiento y, finalmente, de minimizar la toxicidad asociada a tratamientos prolongados21.
Los CPI se seleccionaron primero en base a resultados obtenidos en ensayos enzimáticos en los que se evaluó la capacidad inhibitoria de la actividad de cruzaína recombinante utilizándose Z-F-R-AMC como sustrato25. Aquellos compuestos efectivos a concentraciones nanomolares, se evaluaron en cultivos de células in vitro. A tal efecto, diseñamos un método sencillo que consiste básicamente en irradiar macrófagos de una línea celular para detener su ciclo celular e infectarlos con tripo-mastigotes de cultivo de la cepa Y de T. cruzi, con o sin el agregado de inhibidores a distintas concentraciones en el medio de cultivo. Los cultivos se observan a diario durante 30 días. En estas condiciones, el ciclo intracelular del parásito se completa en 4-5 días en controles no tratados. El grado de efectividad de los compuestos se determina en base a su capacidad de prolongar y/o interrumpir el ciclo intracelular de T. cruzi, o sea de impedir la multiplicación intracelular de amastigotes y la liberación de tripomastigotes. Este segundo método de selección permite descartar inhibidores con buena actividad en ensayos enzimáticos que no son efectivos en cultivos de células por diversas razones incluyendo baja solubilidad, toxicidad para la célula huésped y escasa permeabilidad a través de la membrana celular.
Para determinar la acción parasiticida de los CPI, estudiamos a continuación diversos aspectos de las alteraciones inducidas por el tratamiento de epimastigotes y amastigotes intracelulares a nivel celular y ultraes-tructural23, 24. Mu-F-hF-VSf fue uno de los compuestos más efectivos e indujo la muerte de ambos estadíos de T. cruzi. El tratamiento del parásito con este inhibidor trajo aparejadas: alteraciones en la morfología del complejo de Golgi y del retículo endoplásmico, acumulación de precursores enzimáticos no procesados en dilataciones periféricas de las cisternas del complejo de Golgi y, finalmente, disminución en la cantidad de enzima transportada a los lisosomas. Se observó también una marcada disminución en la cruzaína expresada en la superficie celular del estadío amastigote24. Para confirmar la internalización de los inhibidores y su interacción con cruzaína en células vivas, se incubaron epimastigotes y amastigotes intracelulares con inhibidor radioactivo. Se detectaron bandas radioactivas en el perfil electroforético consistentes con los Mr descriptos para cruzaína que se abolieron específicamente con inhibidor no radioactivo. En resumen, el efecto tripanocida de los CPI se puede atribuir al bloqueo del tráfico normal de proteínas celulares y del proceso de autoactivación de precursores de cruzaína que tiene lugar durante su paso por el complejo de Golgi23, 26. Es importante notar que se observaron alteraciones ultraestructurales similares en amastigotes aislados de músculo cardíaco de ratones infectados con T. cruzi y tratados con CPI, lo que sugiere que el mecanismo de acción de los inhibidores en animales es similar al observado in vitro24.
A continuación, evaluamos en animales experimentales aquellos CPI considerados promisorios tanto en ensayos preliminares de actividad enzimática como en cultivo de células24. La evolución en el diseño de algunos inhibidores de cruzaína y su efecto en la sobrevida de animales infectados con 10 y 100 veces la DL50 de T. cruzi se detallan en la Fig. 1 y Tabla 1. El más efectivo de los compuestos analizados inicialmente durante la fase aguda de la infección en animales infectados con la cepa Y de T. cruzi fue Mu-F-hF-VSf. En experimentos posteriores, este inhibidor se sustituyó con el derivado N-Pip-F-hF-VSf diseñado por J. Palmer (Axys Phar-maceuticals, San Francisco, CA) con el objeto de aumentar la solubilidad en soluciones acuosas sin alterar la afinidad por el sitio activo de la enzima. N-Pip-F-hF-VSf curó una infección letal experimental en ratones de laboratorio en dosis de 0.7 mg administrados tres veces al día i.p. (dosis equivalente a 100 mg/kg de peso/día) por un lapso de 21 días (Tabla 1). Los animales tratados no sólo sobrevivieron la infección letal, sino que 6/10 animales sobrevivieron > 340 días post-infección y presentaron cultivos de sangre reiteradamente negativos, mientras que la totalidad de los controles no tratados murió rápidamente24. La ausencia de parásitos en los ratones tratados se confirmó por hibridización con sondas fluorescentes específicas para T. cruzi (FISH) (C. Thompson, comunicación personal). La observación histopatológica de varios órganos de animales tratados con N-Pip-F-hF-VSf en dosis de hasta 400 mg/kg peso/día durante lapsos prolongados demostró la ausencia de alteraciones debidas al tratamiento, confirmando la baja toxicidad del compuesto.
Estos resultados se confirmaron recientemente en un modelo animal que reproduce algunas de las características de la fase aguda de la enfermedad de Chagas tales como cardiopatía, esplenomegalia y edema (Fig. 2). Ratones C3H infectados con una dosis letal de tripomastigotes del clon CA-I/72 desarrollan la típica cardiopatía chagásica con gran número de parásitos e intensa infiltración (Fig. 3A y 4A) y mueren 25-30 días post-infección. Los animales tratados por vía intra-peritoneal con 0.5 mg de N-Pip-F-hF-VSf dos veces al día (dosis equivalente a 50 mg/kg de peso) durante un total de 21 días no presentan parásitos y sólo se observan pequeñas zonas de cicatrización en el músculo cardíaco (Figs. 3B y 4B) y esquelético. Dichas cicatrices son consecuencia de la infección primaria previa al tratamiento.
En este sentido, cabe mencionar que nuestros estudios preliminares sobre el tratamiento de ratones en fase crónica de infección con N-Pip-F-hF-VSf son también promisorios. Asimismo están en progreso varios estudios paralelos sobre metabolismo y toxicidad en ratas de laboratorio y en perros. En estos últimos, el inhibidor no presenta toxicidad en dosis orales de hasta 1 g/kg de peso.
Los inhibidores de cisteín proteasas son compuestos parasiticidas efectivos aun para parásitos resistentes a la quimioterapia tradicional con nifurtimox y benznidazol, según comprobamos recientemente en tripanosomas resistentes a estas drogas. Inversamente, desarrollamos parásitos resistentes a CPI los que son sensibles a nifurtimox y benznidazol y en los que estamos caracterizando los mecanismos celulares involucrados en la resistencia a estos compuestos27. En base a estos resultados que sugieren que las drogas serían buena alternativas quimioterapéuticas, nuestros grupos de investigación continúan con el diseño y evaluación de nuevos compuestos en búsqueda de inhibidores reversibles e irreversibles de más potencia y especificidad que sean efectivos para el tratamiento no sólo de la enfermedad de Chagas en sus fases aguda y crónica, sino de parasitosis relacionadas tales como leishmaniasis28, tripanosomiasis africana29, toxoplasmosis (S. Reed, comunicación personal) y malaria30.

Agradecimientos: Los autores agradecen a los Drs. James Palmer (Axys Pharmaceuticals, San Francisco, CA), Mary Zimmerman y Robert Smith (Prototek II, Dublin, CA) que proveyeron los inhibidores de cruzaína utilizados en este trabajo. Se agradece al Dr. Curtis Thompson, University of Albur-querque, NM, quien realizó los estudios de FISH. Esta investigación fue financiada con subsidios de los National Institutes of Health (AI35707-1), de la American Heart Association (N° 93.015.380) y del Academic Senate, University of California, San Francisco. JH McKerrow es Docente en Parasitología de la Organización Burroughs Wellcome.

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Abreviaturas:
AMC, 7-amino 4-metilcumarina; DMSO, dimetil sulfóxido; F, fenilalanina; hF, homofenilalanina; FMK, fluoro metilcetona; Mu, morfolino urea; N-Pip, N-piperazina; OCH, compuesto heterocíclico; Vsf, vinil sulfonil fenol; Z, benziloxicarbonilo
TABLA 1.– Evaluación en un modelo animal del efecto terapéutico de inhibidores irreversibles de cruzaína durante la infección aguda con Trypanosoma cruzi

Tratamiento1 Estructura Sobrevida de los
animales (días)2

Control (DMSO) - 8-10
P34081 Mu-F-hF-FMK 16-18
P35027 Mu-F-hF-OCH > 24
K11002 Mu-F-hF-VSf > 180
K11777 N-Pip-F-hF-VSf 240-3403

1 P34081, P35027 se administraron en 2 dosis diarias de 1 mg i.p. durante 12 días. K11777 y K11002 se administraron en 3 dosis diarias de 0.7 y 1 mg i.p., respectivamente, durante 21 días
2 En estos experimentos, los ratones C3H se infectaron con 10.5 (controles, P34081 y P35027) y 10.6 (K11777 y K11002) tripomastigotes de la cepa Y de T. cruzi
3 Los animales se sacrificaron y evaluaron histopatológicamente

Fig. 1.– Evolución de la estructura química de algunos inhibidores irreversibles de cruzaína. En esta figura se muestra el diseño sucesivo de compuestos a partir de uno de los inhibidores irreversibles de cruzaína. Las modificaciones químicas se introdujeron con la finalidad de incrementar la solubilidad, reducir la toxicidad y, finalmente, aumentar la vida media de los compuestos.
Fig. 2.– Aspecto comparativo de ratones C3H infectados con una dosis letal de T. cruzi y tratados o no con CPI. A. Animal tratado por vía intraperitoneal con 0.5 mg de N-Pip-F-hF-VSf dos veces al día durante 21 días. B. El animal no tratado presenta un notorio edema generalizado.
Fig. 3.– Vista general del músculo cardíaco de ratones C3H infectados con una dosis letal de T. cruzi. A. Los animales no tratados (controles) presentan una intensa infiltración difusa generalizada (s). B. En los animales tratados con N-Pip-F-hF-VSf se nota escasa infiltración linfocitaria (Aumento 4X).
Fig. 4.– Histopatología del músculo cardíaco de ratones tratados con CPI durante la fase aguda de la enfermedad de Chagas. A. En los animales no tratados se destacan numerosos nidos de amastigotes intracelulares (s) y una intensa infiltración celular. B. Se nota la ausencia de parásitos intracelulares y de infiltración linfocitaria en los animales tratados (Aumento 20X).