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MODELOS MURINOS DE ENFERMEDADES HUMANAS
MODELOS MURINOS DE ENFERMEDADES HUMANAS† Fernando Benavides1, Jean-Louis GuEnet2 1Department of Carcinogenesis, M.D. Anderson Cancer Center, The University of Texas, Smithville, TX, USA; 2Unité de Génétique des Mammifères, Institut Pasteur, Paris, France †Extracto del libro Manual de Genética de Roedores de Laboratorio: Principios Básicos y Aplicaciones, F.J. Benavides, J-L. Guénet (en preparación) Resumen Este artículo es una revisión bibliográfica acerca de las mutaciones disponibles en el ratón de laboratorio, espontáneas, inducidas o generadas por manipulación genética, que son utilizadas como modelo de enfermedades humanas. Desde los comienzos del siglo pasado hasta nuestros días, los modelos murinos han contribuido a la comprensión de la patogénesis de muchas enfermedades y al desarrollo de nuevas terapias. La tendencia actual de las investigaciones biomédicas nos hace pensar que en el futuro próximo la disponibilidad de modelos murinos se verá muy acrecentada por la gran cantidad de técnicas de manipulación genética y proyectos de mutagénesis química existentes. La denominada era “pos-genómica” ya está entre nosotros y será esencial contar con estos modelos animales para el estudio funcional de las secuencias obtenidas de los proyectos de secuenciación del genoma humano y murino. Palabras clave: modelos animales, enfermedades hereditarias, ratón de laboratorio Abstract Murine models for human diseases. This article is a bibliographic review concerning mouse mutations, spontaneous, induced or genetically engineered, as models of human genetic diseases. Since the beginning of the last century, mouse models have been instrumental in the understanding of the pathogenesis of many diseases and designing of new therapies. A number of recent technological advances in embryo manipulation and many large-scale mutagenesis screens will dramatically increase the availability of new mouse models in the near future. In the “post-genomic” era, mouse mutants will have a significant role as a model system for functional genome analysis of the upcoming whole-genome information of the human and mouse genomes projects. Key words: animal models, genetic diseases, laboratory mouse
Dirección postal: Dr. Fernando Benavides,
Department of Carcino-genesis, Science Park. M.D. Anderson Cancer
Center, The University of Texas, Park Road 1C, P.O. Box 389,
Smithville, Texas 78957, USA. Recibido: 28-IX-2000 Aceptado: 18-X-2000
El ratón como modelo en Medicina Experimental Desde que Sir A. Garrod descubrió en 1902 que la alcaptonuria era
consecuencia de un desorden metabó-lico que se heredaba en forma
mendeliana simple, muchas otras patologías humanas fueron reconocidas
como el resultado de un defecto en la constitución genética de los
individuos afectados. En forma paralela ha este desarrollo del
conocimiento sobre la patología humana, se identificaron, o crearon,
modelos animales de distintas enfermedades humanas. Estos modelos
ayudan a la comprensión de la patogénesis de muchas enfermedades y
pueden ayudar en el desarrollo de terapias que sustituyan la función
defectiva de un gen determinado. - Al tratarse de un mamífero, una gran parte de sus procesos
bioquímicos son similares al hombre, aunque no hay que perder de
vista que no se trata de un humano en miniatura. 1. Modelos provenientes de mutaciones espontáneas o inducidas Estas mutaciones se encuentran listadas, con una pequeña descripción y bibliografía, en el libro “Genetic Variants and Strains of the Laboratory Mouse” (1996). Las listas actualizadas pueden encontrase en Internet (MGI: http//:www.informatics.jax.org) o puede consul-tarse revistas especializadas* . Muchas de estas mutaciones han demostrado ser modelos muy interesantes para el entendimiento de los procesos del desarrollo de los mamíferos y algunas de ellas, alrededor de 100, han sido clasificadas como modelos homólogos de enfermedades humanas, lo que significa que la homología se extiende al nivel molecular. Tres ejemplos de este tipo de mutaciones son: la mutación aku, modelo de la alcaptonuria humana, la mutación hph1, modelo de la fenilcetonuria y, finalmente, la mutación mdx, modelo de la distrofia muscular de Duchene/Becker2, 3. 2. Modelos generados por transgénesis Modelos producidos a través de la eliminación de un determinado tipo celular Estos ratones transgénicos son diseñados usando secuencias reguladoras específicas de tejido asociadas a secuencias que codifican para proteínas citotóxicas (o potencialmente citotóxicas) con el fin de programar la ablación de un tipo celular específico. Esta eliminación selectiva nos provee de un método directo para generar animales a los cuales les falte un tipo celular específico e inclusive hasta un linaje celular completo. La estrategia más común hace uso de secuencias que codifican para proteínas tóxicas como ser la cadena A de la toxina diftérica o de la ricina, ambas bloquean la síntesis de proteínas por parte de la célula. En este caso, el efecto citotóxico se produce inmediatamente después de la activación del transgén en el tejido blanco (debido a los promotores específicos de tejido). Otra estrategia se basa en la expresión intracelular inducida de la enzima timidina quinasa derivada del virus del herpes (HSV-tk). Esta enzima no es directamente tóxica para las células pero, a diferencia de la timidina quinasa de los mamíferos, puede fosforilar ciertos análogos de nucleósidos como el acyclovir y el gancyclovir, convirtiéndolos en sustancias tóxicas para las células. De esta manera, el efecto letal para las células esta condicionado al tipo de tejido seleccionado donde se expresará la timidina quinasa viral (debido a un promotor específico de tejido) y al agregado de los análogos de nucleósido. Algunos modelos de enfermedades humanas han sido creados por esta metodología, por ejemplo ratones con inmunodeficiencia de linfocitos B y ratones deficientes en mielina, estos últimos a través de la eliminación selectiva de la población de oligodendrocitos. Actualmente, el uso de recom-binasas sitio-específicas como Cre o Flp han provoca-do un vuelco hacia este tipo de transgénesis condicional4, 5, 6. Modelos producidos a través de una regulación anormal del gen Uno de los mejores ejemplos de este tipo de animal transgénico es el clásico ratón gigante producido en 1982 por la sobreexpresión de la hormona de crecimiento de la rata. En este caso, la expresión del gen era llevada a cabo por el agregado de un promotor ubicuo (el promotor del gen de la metalotionina), lo que llevaba a la expresión constitutiva de la hormona de crecimiento con el dramático efecto en el tamaño del ratón. Otro ejemplo es la asociación, en la construcción de un animal transgénico, de un oncogén con un promotor ubicuo, lo que lleva al desarrollo de una alta frecuencia de neoplasias. En cambio, cuando el promotor utilizado es específico de tejido los tumores aparecen sólo en el tejido blanco. Por ejemplo, Heisterkamp y colaboradores produjeron un modelo de ratón transgénico para la leucemia aguda humana por medio de la introducción de un segmento quimérico de ADN conteniendo un exón del gen bcr con un exón del oncogén c-Abelson. Esta misma fusión se produce en los pacientes leucémicos como resultante de una translocación recíproca 9q34-22q11, denominada cromosoma Filadelfia. El modelo transgénico sirvió para comprobar la causa de la leucemia humana pero, lamentablemente, no es demasiado útil para el estudio de la evolución de la enfermedad porque los ratones mueren a una edad muy temprana7, 8. Modelos producidos por la incorporación de genes humanos Existen muchos ejemplos de esta clase de transgénicos, entre los más destacados podemos nombrar el caso del ratón transgénico sensible al virus de la polio y los modelos murinos para la osteogénesis imperfecta tipo II y para la anemia falciforme (“sickle-cell anemia”). En el primer caso, se produjeron ratones transgénicos para todos las cepas de virus de la poliomielitis incorporando en el genoma murino el gen humano que codifica para el receptor celular del virus. Al ser inoculados con el virus, estos ratones transgénicos reproducen los síntomas clínicos observados en humanos y primates y por lo tanto representan un modelo excelente para los estudios moleculares de la patogénesis de la poliomielitis, así como para la evaluación de nuevas vacunas9. Modelos transgénicos producidos por la incorporación de grandes fragmentos de ADN Se han descripto varias técnicas capaces de llevar a cabo la
incorporación de grandes segmentos de ADN (hasta 900 kb) a la línea
germinal de los ratones utilizando vectores YAC o BAC. Entre esas
técnicas, la microin-yección directa de un YAC purificado en el
pronúcleo de un huevo fertilizado aparece como la más utilizada.
Este tipo de transgénicos son de gran utilidad cuando el defecto
genético resulta de una alteración cuya causa molecular es
desconocida o poco estudiada6, 10, 11. Utilizando este sistema se han
creado dos modelos originales de enfermedades humanas muy complejas,
como son la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y el síndrome de
Down12, 13. 3. Modelos generados in vitro por manipulación de células ES La disponibilidad de cultivos de células pluripotenciales
(células ES) ha ampliado enormemente el espectro de las posibilidades
de manipulación del genoma murino, en particular las mutaciones
dirigidas o ratones “knock-out” (KO). Con las células ES es
posible crear modelos murinos a partir de (i) células ES mutantes
seleccionadas in vitro, (ii) por “transgénesis in vitro” de las
células ES (haciendo uso de una batería de técnicas de
transfección de ADN) y (iii) por medio de la utilización del
fenómeno de recombinación homóloga in vitro. Existe en la
actualidad un crecimiento enorme en el número de ratones KO que
plantea un verdadero problema de espacio en todos los bioterios. Como
ejemplo basta mencionar que las predicciones para el año 2001 hablan
de 3000 publicaciones utilizando ratones KO. 4. Modelos generados por transgénesis condicional (sistemas Cre/loxP y Flp/frt) La estrategia de creación de transgénicos “condicionales”, ya sean éstos temporales o espaciales, por medio del uso de recombinasas sitio-específicas ha sido descripta en detalle en el libro de Jackson y Abott (2000). Las posibilidades de crear modelos es inmensa ya que podemos provocar la falta de expresión de un gen, o la expresión de un alelo mutado, en un tejido específico y/o en un momento del desarrollo determinado. Por lo tanto, esta estrategia es la única capaz de ser utilizada para el estudio de la inactivación de genes que son esenciales para el desarrollo pero tienen un patrón de expresión reducido. Una de las tantas posibilidades que ofrecen estos sistemas es la de generar deleciones, inversiones y translocaciones de grandes segmentos cromosómicos. Un ejemplo interesante es la translocación entre el oncogén Myc y los genes de cadena pesada de las inmunoglobulinas, en los cromosomas 15 y 12 respectivamente, reportada por Smith y colaboradores en 1995. Esta translocación generada por el sistema Cre/loxP reproduce aquellas que son producidas en los plasmo-citomas14. Las mutaciones como modelos para el estudio de enfermedades humanas El descubrimiento de mutaciones en el ratón (con patologías similares a enfermedades humanas) es una situación frecuente en los bioterios. A lo largo del siglo XX se han descripto más de 1.000 mutaciones –entre espontáneas e inducidas–, muchas de ellas de gran valor en medicina experimental (ver el “Mouse Locus Catalog” en http://www.informatics.jax.org/locus.html). Además de estas mutaciones espontáneas e inducidas se han creado miles de líneas de ratones transgénicos y KO (ver http://www.biomednet.com/db/mkmd), las cuales son potencialmente útiles en la identificación de células o tejidos blanco en ciertas patologías y también en el desarrollo de nuevas terapias17, 18. En términos didácticos, podemos decir que los modelos animales en medicina experimental pueden ser útiles fundamentalmente para tres propósitos: (i) identificar la base molecular de la enfermedad, (ii) estudiar la fisiopatología de la enfermedad y, (iii) ensayar nuevas terapias para la misma19, 20. 1. Modelos murinos de enfermedades hereditarias simples (mendelianas) Enfermedades que involucran células derivadas de la cresta neural Las células que derivan de la cresta neural se diferencian en diversos tipos celulares entre los cuales encontramos a los melanocitos de la piel y el oído interno, las neuronas y células de la glía del sistema nervioso periférico, células neuroendócrinas de las glándulas adrenal y tiroides, e inclusive componentes de los huesos cartilaginosos y membranosos de la cabeza. En la Tabla 1 podemos observar una lista de genes en los cuales se han identificado mutaciones, tanto en el ratón como en sus homólogos humanos, y que causan deficiencia de células derivadas de la cresta neural. Todos estos modelos tienen aspectos comunes entre el fenotipo mutante y la correspondiente enfermedad humana. Nos limitaremos a presentar brevemente tres de esas enfermedades: Enfermedad de Hirshprung (HSCR) Las personas afectadas por este desorden tienen deficiencias en los ganglios nerviosos entéricos lo que resulta en megacolon, bloqueos intestinales y constipación crónica. Existen formas dominantes y recesivas de la enfermedad. Diversas mutaciones en el proto-oncogén RET son la causa de la forma dominante de esta enfermedad hereditaria humana, mientras que las formas recesivas se deben a mutaciones en la endotelina 3 (gen EDN3* ) y su receptor tipo B (gen EDNRB). Para los tres genes mencionados se han desarrollado ratones KO que han aportado valiosa información respecto a la patogenia de la enfermedad, aunque existen algunas diferencias fenotípicas con la enfermedad humana. Esto demuestra que muchas veces los tejidos murinos y humanos responden de manera diferente a la falta de función de un determinado gen. Existen dos mutaciones espontáneas en el ratón que resultaron ser alélicas de los genes murinos Edn3 (cromosoma 2) y Ednrb (cromosoma 14), se trata de lethal spotting (ls) y piebald (s), respectivamente (alelos Edn3ls y Ednrbs)21. Piebaldismo (PT) El piebaldismo (“piebald trait” o PT), presenta una deficiencia en la migración de los melanocitos hacia la piel y el oído interno originando defectos en la pigmentación del pelo e hipopigmentación en la piel de la frente, pecho y abdomen. Además, son frecuentes los epiteliomas, las sorderas ocasionales y la heterocromía del iris. Numerosas mutaciones en el oncogén Kit son las responsables del piebaldismo en los humanos y del “Dominant white spotting (W)” en el ratón. La mutación W fue descripta en 1908 y ha sido ampliamente estudiada a lo largo del siglo XX, ya que se trata de un locus muy sensible a la aparición de mutaciones. El locus W (ahora KitW) se localiza en el cromosoma 5 del genoma murino y se han identificado alrededor de 60 alelos diferentes. Los ratones heterocigotas exhiben manchas blancas en la cabeza y el vientre, un fenotipo muy similar al del piebaldismo humano. Los ratones homocigotas (KitW/KitW), en su inmensa mayoría, mueren durante el desarrollo embrionario. Sólo algunos alelos, denominados viables (v), permiten la sobrevida de los ratones homocigotas (KitW-v/KitW-v), aunque éstos son anémicos, estériles, sordos y de pelaje blanco, pero, a diferencia de los albinos, tienen ojos oscuros, ya que no está afectada la migración de los melanocitos hacia la retina. Es interesante que todas las mutaciones, tanto en el hombre como en el ratón, afectan el dominio tirosina quinasa de la proteína. El fenotipo que estamos describiendo es idéntico al que muestran los ratones afectados por la mutación Steel (Sl). El locus Sl (ahora KitlSl) se localiza en el cromosoma 10 del ratón y codifica para el ligando natural del receptor Kit (gen Kitl “kit ligand”). Sorprendentemente, no se han identificado mutaciones en este gen en personas con piebaldismo22. Síndrome de Waardenburg (WS) Se trata de una enfermedad dominante y ha sido clasificada por los clínicos en tres tipos: WS1, WS2 y WS3. Este síndrome presenta anomalías en la migración de los melanocitos hacia la piel y el oído interno llevando a defectos en la pigmentación del pelo y los ojos, además de sordera. Al igual que HSCR, WS es genéticamente heterogénea, comprendiendo mutaciones en dos factores de transcripción, PAX3 (“paired box gene-3”) y MITF (“microphthalmia transcription factor”). A su vez, existen más de 30 mutaciones del gen PAX3, afectado virtualmente cada dominio de la proteína. En el ratón, Pax3 y Splotch (Sp) son alélicos (cromosoma 1), siendo este último un alelo mutante del gen Pax3 (su nueva nomenclatura es Pax3Sp). Splotch es una mutación semi-dominante que presenta varios alelos (Sp, Spd, Sp2H, entre otros) que causan manchas blancas en el abdomen, cola y pies en el estado heterocigota. Los ratones homocigotas suelen morir durante la gestación por severos defectos en el tubo neural y los ganglios espinales. Una vez más, existen diferencias entre el modelo de ratón mutante y la enfermedad humana, en este caso los ratones afectados por las mutaciones en el gen Pax3 nunca presentan sordera ni defectos en el oído interno23. El gen murino Mitf resultó ser codificado por otro locus mutante, microphthalmia (mi), ahora Mitfmi (cromosoma 6). El locus mi es particularmente fascinante porque presenta muchos alelos disponibles para el estudio y, además, estos alelos despliegan una plétora de fenotipos y un patrón de herencia complejo. Todos los alelos de mi causan anomalías en los melanocitos que llevan a defectos en la pigmentación y sordera. En general los alelos más severos se comportan en forma semi-dominante y los alelos menos severos son recesivos, estando localizadas las mutaciones, para cada clase, en dominios específicos de la proteína24. Desórdenes en la visión El oído y los ojos del ratón son anatómicamente y funcionalmente
muy similares a los del hombre (y a los de los mamíferos en general),
convirtiendo al ratón en un modelo muy útil para el estudio de estos
órganos. Además, existe una provisión de mas de 150 loci mutantes
que afectan el oído y los ojos del ratón. En la Tabla 2 podemos
observar algunos de estos mutantes que han resultado ser excelentes
modelos, ya que comparten sorprendentes similitudes en el fenotipo. Desórdenes en la audición Pese a que las sorderas pueden agruparse en varias categorías según el sitio del sistema auditivo que esté fallado, en el humano la forma más común de sordera es aquella que afecta el órgano de Corti, responsable de las transducciones auditivas. Debido a la gran cantidad de genes envueltos en las sorderas hereditarias, los análisis de ligamiento fueron siempre muy difíciles de realizar en humanos. Una vez más, el ratón jugó un papel fundamental para lograr uno de los hitos en el estudio de las sorderas de origen genético: el clonaje del primer gen vinculado a las transducciones auditivas. Hasta el momento, dos genes perteneciente al grupo de las miosinas no convencionales, Myo7a (cromosoma7) y Myo6 (cromosoma 9), fueron aislados en el ratón. El gen homólogo humano (MYO7A) fue identificado posteriormente en pacientes con el síndrome de Ushers tipo 1B, la forma más común de sordera con ceguera asociada. Las similitudes fenotípicas (ambos comparten la degeneración del órgano de Corti) y los mapeos comparativos dieron los primeros indicios de que la mutación murina shaker1 (sh1), asociada a sordera, era homóloga al síndrome de Ushers tipo 1B. Actualmente se sabe que la mutación sh1 es un alelo mutado del gen Myo7a, por lo tanto su nueva nomenclatura27 es Myo7ash1. Enfermedades de los huesos y cartílagos Dentro de los mecanismos implicados en los desórdenes
esqueléticos podemos encontrar: (i) las alteraciones que afectan la
composición bioquímica del hueso, (ii) las fallas en el patrón del
desarrollo óseo durante la embriogénesis y (iii) la imposibilidad de
establecer las proporciones correctas en el crecimiento de los huesos.
En el ratón se han descripto más de 100 loci y modelos transgénicos
que afectan el desarrollo del esqueleto. En la Tabla 3 se muestra una
lista de genes murinos, y sus respectivas enfermedades homólogas
humanas, que se encuentran involucrados en diversos trastornos óseos.
Todos estos modelos animales presentan fenotipos que imitan, o
permiten explicar, algunos aspectos de la correspondiente enfermedad
humana. Desórdenes neurológicos y neuromusculares Existen alrededor de 150 mutaciones en el ratón que causan defectos neurológicos, neuromusculares o comportamentales. Entre ellas, hay unas 20 que pueden ser consideradas como modelos de enfermedades humanas, fundamentalmente aquellas que comparten un fenotipo neuromuscular o neurológico con el correspondiente desorden humano (ver Tabla 4). Enfermedad de Alzheimer (EA) Este desorden neurodegenerativo es la cuarta causa de muerte en los países desarrollados. Se trata de una demencia progresiva en la que ciertas zonas específicas del cerebro sufren degeneración neuronal, lo que lleva a la pérdida de la memoria y de las capacidades cognitivas. En los últimos años, diversos laboratorios han producido ratones transgénicos que exhiben algunos de los cambios patológicos asociados a EA. Esto ha ocurrido, por ejemplo, con los transgénicos que expresan niveles muy altos de la proteína amiloide b (gen App), forma “wild type”, o aquellos que expresan una forma mutante de la misma, particularmente una mutación puntual encontrada en pacientes con EA. Ambos modelos comparten grandes similitudes con los casos humanos, sin embargo, las placas seniles (uno de los rasgos histopatológicos característicos de EA) se encuentran sólo en los ratones transgénicos para el gen mutado. Ninguno de los dos tipos de transgénicos para el gen App desarrolla ovillos neurofibrilares o “tangles”, la otra lesión histopatológica característica de EA. Cabe destacar que estos ratones transgénicos exhiben defectos en el aprendizaje, así como alteraciones cerebrales al envejecer. Además, se ha demostrado que el fondo genético de los ratones tiene un efecto muy fuerte sobre el fenotipo. Siendo que la función del gen App es muy poco conocida (más allá de ser requerida para el funcionamiento neuronal), estos ratones son un modelo muy útil para comprender el papel del gen APP en pacientes con EA. Otro gen involucrado en EA es el gen de la Apolipopro-teína E (APOE). Pese a que, originalmente, los ratones homocigotas para formas mutadas del gen Apoe fueron reportados como neurológicamente normales, estudios más recientes demostraron que existen alteraciones de la sinapsis y cierto nivel de neurodegeneración del SNC en ratones nulos para el gen Apoe (Apoe -/-)31. Desórdenes neuromusculares Básicamente, las anormalidades neuromusculares pueden resultar de
(i) fallas en la excitación- contracción del músculo esquelético,
(ii) defectos en el metabolismo muscular y (iii) degeneración y/o
debilidad muscular. En la Tabla 4 hay algunos ejemplos de modelos
murinos pertenecientes a la primera categoría (mutación Cchl1a3 y
ratones KO para el gen Ryr1) y a la segunda categoría (mutación
Phk). Existen modelos murinos muy interesantes para la última
categoría de enfermedad neuromuscular, los cuales describiremos más
detalladamente. En el hombre, se han descripto dos enfermedades
neuromusculares ligadas al cromosoma X: la distrofia muscular de
Duchene (DMD) y la distrofia muscular de Becker (DMB). Ambas
enfermedades han sido atribuidas a mutaciones en el gen de la
distrofina, una gran proteína citoesquelética localizada en el
sarcolema del músculo esquelético. El gen responsable de la DMD fue
el primer gen relacionado a una enfermedad humana de gran importancia
que fuera descubierto a través de un clonaje posicional. Los mapeos
comparativos y las similitudes en el fenotipo llevaron a descubrir que
el homólogo de DMD en el ratón era la mutación mdx (X-linked
muscular dystrophy). En el año 1989, Sicinski y colaboradores
informaron de la presencia de una mutación puntual del gen Dmd en los
ratones mutantes mdx (ahora Dmdmdx). Fundamentalmente, los pacientes
con DMD y los ratones mdx/mdx presentan una necrosis extensiva de las
fibras musculares esqueléticas, siendo este tejido muchas veces
reemplazado por tejido fibrótico y adipocitos. Sin embargo, en los
ratones mdx existe un alto grado de regeneración muscular lo que
permite a los animales permanecer casi sin síntomas hasta el año de
vida. A pesar de esta diferencia, varios laboratorios han usado esta
mutación como modelo de DMD y DMB y en especial para el estudio de
posibles terapias génicas. Muy recientemente, en 1996, se creó un
modelo murino que se acerca aún más a la patología muscular
presente en DMD, especialmente por la falta de regeneración muscular.
Se trata de un doble mutante que porta mutaciones en los genes mdx y
Myod (gen que codifica para un factor de transcripción miogénico)32,
33, 34. Enfermedades de la piel y el pelo En la mayoría de las enfermedades no infecciosas que afectan la
piel y el pelo se desconoce aún su fisiopato-logía, y en este
sentido, los modelos animales podrían proveer de buenos indicios
sobre las causas de dichas enfermedades. El objetivo último de la
investigación dermatológica es entender los fundamentos moleculares
de estos procesos para diseñar nuevos métodos de diagnóstico,
prevención y terapia. En particular, las anomalías de la piel y el
pelo son rasgos anatómicos muy evidentes, por lo que los animales
mutantes son descubiertos rápidamente por los técnicos de bioterio.
Como resultado, existen en la actualidad más de 100 mutaciones en el
ratón que causan anormalidades morfológicas en la piel y el pelo, de
las cuales sólo unas pocas tienen una base molecular definida36. Enfermedades hematológicas e inmunodeficiencias Los desórdenes sanguíneos forman parte de las enfermedades hereditarias humanas que primero se descubrieron, como ser la hemofilia ligada al X, las anemias por defectos en los genes de las globinas y algunas inmunodeficiencias. Para todas ellas existen modelos experimentales en el ratón con grandes similitudes fenotípicas con la contraparte humana. Algunos de estos modelos, transgénicos o espontáneos, se encuentran listados en la Tabla 5. Teniendo en cuenta que los tejidos hematopoyéticos son de fácil acceso (aptos para aislar células primordiales) y sabiendo de la disponibilidad de líneas isogénicas de ratones, muchos laboratorios han redoblado sus esfuerzos en realizar trabajos en el área de la terapia génica. Anemias La anemia falciforme (“Sickle cell anemia”), enfermedad crónica que afecta principalmente a individuos con antepasados provenientes de Africa y de la cuenca del mediterráneo, fue una de las primeras enfermedades en asociarse con un defecto molecular al comprobarse que su herencia estaba ligada a una mutación en el gen de la b globina. Es interesante describir cómo se creó un modelo murino para la anemia falciforme utilizando los genes de las globinas. El principal inconveniente del ratón transgénico que co-expresaba el gen humano de la g globina y el gen (humano) mutado de la b globina [bS(6Val)] era que no desarrollaba el fenotipo anémico porque la b globina endógena (murina) interfería con la polimerización de las dos cadenas humanas. Este problema fue resuelto introduciendo los transgenes g y b globina humanos en ratones que portan una mutación nula (inducida químicamente) en el gen de la b globina murino. De esta manera, y con el agregado de otros transgenes humanos responsables de la anemia falciforme, se cuenta actualmente con varios modelos experimentales en el ratón, exhibiendo una gama de fenotipos que abarca desde los más suaves a los más severos40, 41. Inmunodeficiencias Los modelos murinos de inmunodeficiencia son variados y en general
muestran una buena correlación con la enfermedad humana que se quiere
estudiar. Además, estos modelos han sido muy útiles para los
estudios de muchos procesos fundamentales de la respuesta inmune como
ser la adhesión celular, la comunicación entre linfocitos T y B, la
presentación de las moléculas del CMH, las transducción de señales
por tirosina quinasa etc. Fenómenos autoinmunes y linfoproliferativos Muchas enfermedades humanas, como la diabetes, el lupus, la artritis y la glomerulonefritis poseen un componente autoinmune. Existen dos mutaciones espontáneas del ratón que han sido esenciales en el descubrimiento del rol de la apoptosis en el mantenimiento de la autotolerancia dentro del sistema inmune. Estas son las mutaciones lymphoproliferation (lpr) y generalized lymphadenopathy (gld). Son dos mutaciones autosómi-cas recesivas surgidas independientemente en las cepas MRL/Mp y C3H/HeJ, respectivamente, y ambas coinciden en su fenotipo semejante a procesos autoinmunes en humanos. En su corta vida, estos ratones desarrollan agrandamiento masivo de ganglios linfáticos, esplenomegalia pronunciada, desarrollo de glomerulonefritis por complejos inmunes, poliarteritis degenerativa y lesiones articulares que se asemejan a la artritis reumatoidea. La causa molecular de la mutación lpr es un defecto en el gen Fas (cromosoma19), gen que codifica para un antígeno perteneciente a la familia de los receptores de TNF (“tumor necrosis factor”), mediador de la apoptosis. Recientemente se identificaron mutaciones en el gen homólogo humano FAS en pacientes con Síndrome Linfoproliferativo Autoin-mune. Por otro lado, se comprobó que la mutación gld involucra al gen Fasl, que codifica para el ligando del antígeno Fas46. Enfermedades metabólicas En la Tabla 6 se describen mutaciones en varios genes murinos que sirven como modelo experimental en enfermedades metabólicas y hormonales. Entre ellos, hay dos modelos (Hexa y Hprt) que ilustran muy bien el hecho de que el ratón y el hombre, si bien son muy parecidos para muchas vías metabólicas, presentan a veces diferencias importantes. Desórdenes en el metabolismo de la purina Los nucleótidos púricos (purinas) son reciclados a partir de las
bases púricas por la acción de dos enzimas: APRT (“adenine
phosphoribosyl transferase”) y HPRT (“hypoxantine guanine
phosphoribosyl transferase”). Ante la ausencia de APRT la adenina es
convertida en un producto insoluble que se deposita en los riñones
formando cálculos y, a la larga, generando deficiencia renal. La
deficiencia de HPRT en humanos causa el síndrome de Lesch-Nyhan, una
enfermedad ligada al X caracterizada por retardo mental y
automutilación compulsiva47. Fibrosis Quística (FQ) La fibrosis quística es la enfermedad hereditaria letal más común entre la gente de raza caucásica y se caracteriza por un transporte defectuoso de los iones de cloro a través de las membranas y por una producción excesiva de moco por parte de las células epiteliales. A pesar de que la causa de mortalidad de los pacientes con FQ es, fundamentalmente, la presencia de infecciones pul-monares, otras afecciones como las obstrucciones pulmonares, la inflamación del páncreas, del conducto biliar y los vasos deferentes son también parte de la sintomatología. El gen responsable de esta enfermedad (CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) se aisló en 1989 y desde ese momento han sido descriptas una gran cantidad de mutaciones en los pacientes afectados. Los ratones homocigotas nulos (KO) para el gen Cftr tienen una alta mortalidad neonatal como resultado de obstrucciones intestinales, síntoma que ocurre sólo en una minoría de los pacientes con FQ. Aparentemente, los defectos intestinales hacen que estos ratones vivan poco tiempo y por lo tanto la enfermedad pulmonar no llega a manifestarse. Por otro lado, una variante de ratón transgénico en el cual se permite una expresión residual del gen Cftr ha permitido alargar la vida de los ratones y lograr un modelo experimental que se acerca más al humano, incluida la enfermedad pulmonar49, 50. Arteriosclerosis Las enfermedades cardiovasculares que genera la arteriosclerosis son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. La patogénesis de la arteriosclerosis es compleja e incluye una combinación de factores ambientales y genéticos. Entre los primeros se encuentran la dieta y el nivel de lípidos en la sangre. La hipercolesterolemia familiar fue una de las primeras enfermedades genéticas relacionadas al metabolismo del colesterol y comprende mutaciones en el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR). Otro factor de riesgo para la arteriosclerosis es la hiperlipoproteinemia tipo III asociada a diferentes formas alélicas del gen APOE. Entre los modelos murinos de esta enfermedad encontramos los ratones nulos (KO) para los genes Apoe y Ldlr. El primero desarrolla hipercolesterolemia y lesiones arterioscleróticas a temprana edad, inclusive si se los alimenta con dietas de bajo contenido graso. Los ratones Ldlr -/- presentan un fenotipo similar pero bastante más atenuado. Estos dos modelos murinos son muy útiles para el estudio de los mecanismos del desarrollo de las lesiones arterioscleróticas y también para el ensayo de posibles terapias génicas. De todas formas, se sugirió que la arteriosclerosis en el ratón estaría afectada por otros genes involucrados en el metabolismo de los lípidos51, 52. 2. Modelos murinos de enfermedades hereditarias complejas (multigénicas) Cáncer A principios del siglo XX, cuando se comenzó a experimentar con
las primeras cepas consanguíneas de ratones, se demostró claramente
que la susceptibilidad a ciertos tipos de cáncer se comportaba como
un rasgo hereditario y que tenía una gran influencia de parte del
fondo genético de los ratones estudiados. Posteriormente se
descubrió que, efectivamente, la susceptibilidad al cáncer era
también un rasgo hereditario en los humanos y que existían “cánceres
familiares” en los cuales los individuos afectados desarrollaban un
espectro definido de tumores. Hoy sabemos que muchos de esos cánceres
familiares están representados por mutaciones germinales en genes
supresores de tumores, genes de reparación del ADN u oncogénes,
muchas veces acompañado por fenómenos de inestabilidad genómica. Es
importante aclarar que el cáncer familiar, del cual nos ocuparemos
aquí, es sólo una parte mínima de los casos de cáncer en humanos,
siendo la mayoría espontáneos o no hereditarios. En este último
caso las causas genéticas son muy diversas, incluyendo interacciones
complejas entre muchos genes, y los fenómenos de carcinogénesis se
presentan en pasos múltiples. Existe un abanico enorme de modelos
murinos para el estudio experimental del cáncer, abarcando distintas
cepas consanguíneas, mutaciones espontáneas, ratones transgénicos y
KO. Las ventajas más importantes que ofrecen estos modelos, en
contraposición a las líneas celulares tumorales (humanas), son (i)
la posibilidad de estudiar el efecto de las mutaciones que predisponen
al cáncer en un fondo genético uniforme y (ii) la posibilidad de
llevar a cabo todo tipo de estudios básicos y ensayos terapéuticos
in vivo2, 3. Cáncer colorectal En el año 1993 se publicaron una serie de artículos que
revolucionaron la visión que se tenía sobre el cáncer hereditario.
Estos estudios demostraron por primera vez que los genes de
reparación del ADN (aislados originalmente de levaduras) jugaban un
papel crucial en el cáncer de colon familiar. Brevemente, la
predisposición genética a desarrollar este tipo de cáncer resulta
de mutaciones germinales en los genes de reparación del ADN. Por
ejemplo, los individuos heterocigotas para una mutación en el gen
MSH2 (MutS homolog 2- homólogo del gen de la levadura MutS)
desarrollan cáncer de colon familiar no relacionado con poliposis
tipo 1. Se ha comprobado que este tipo de mutaciones provoca
inestabilidad genómica generalizada y que la misma puede medirse por
la presencia de cambios en el tamaño de los microsatélites de ADN,
fenómeno denominado “inestabilidad de los microsatélites”- MSI
(microsatellite instability). De la misma forma, otras mutaciones de
genes de reparación del ADN, el MLH1 (MutL homolog 1- homólogo del
gen de la levadura MutL) y el PMS2 (postmeiotic segregation increased
2), son responsables del cáncer de colon familiar no relacionado con
poliposis tipos 2 y 3, respectivamente. Efectivamente, los ratones KO,
deficientes para los genes Msh2 y Pms2, son viables y fértiles pero a
partir de los dos meses de vida, empiezan a desarrollar linfomas y
sarcomas que muestran MSI como indicio de que existen fallas en el
sistema de reparación del ADN55, 56. Síndrome de Li-Fraumeni Esta rara enfermedad, del tipo autosómica recesiva, es uno de los cánceres familiares mejor estudiados. Los pacientes afectados desarrollan una serie de tumores, entre los que se encuentran carcinomas de mama y de cerebro, osteosarcomas y leucemias, entre otros. La mutación germinal asociada a este síndrome afecta al gen supresor de tumores TRP53 (cromosoma17q), más conocido como p53. Este gen supresor de tumores es además uno de los genes más afectados en las formas esporádicas (no familiares) de muchos tipos de cáncer, hallándose mutaciones espontáneas en la mitad de todos los tumores primarios. Como en el caso de los pacientes afectados por el Síndrome de Li-Fraumeni, los ratones heterocigotas para un alelo nulo del gen Trp53 (cromosoma11) desarrollan tumores, pero con un período de latencia mucho más largo que los ratones homocigotas. Es interesante resaltar que, dependiendo del fondo genético de la cepa, se desarrollan distintos tipos de tumores en estos ratones transgénicos. Esta característica es muy útil para poder aislar posibles genes modificadores (“modifier genes”) de la incidencia tumoral58. Obesidad y diabetes La mutación espontánea ob (obese, cromosoma 6) fue descripta en
The Jackson Laboratory (USA) en el año 1949 en la cepa endocriada
C57BL/6. La identificación del gen responsable, Lep (leptin), una
hormona que regula el control del peso, fue lograda hace algunos años
y es un ejemplo clásico de clonaje posicional. La presencia del gen
mutado produce una marcada obesidad asociada con hiperfagia e
hiperinsulinemia. La ganancia de peso en los ratones Lepob/Lepob puede
alcanzar dos a tres veces los valores de un ratón normal. Los
estudios sobre obesidad en los ratones ob fueron complementados con
estudios similares en otra mutación clásica del ratón de
laboratorio que imita el fenotipo de los ratones obesos, estamos
hablando de la mutación diabetes (db) en el cromosoma 4 del ratón.
Existen varias mutaciones independientes de esta mutación, aparecidas
espontáneamente en The Jackson Laboratory y en el Instituto Pasteur
de París. Finalmente se descubrió que se trataba del gen que
codificaba para el receptor de la leptina (Leprdb)59 El valor y las limitaciones de las mutaciones como modelo de enfermedades humanas Cuantos más modelos homólogos son identificados, más obvia se
hace la existencia de diferencias en la severidad de la enfermedad
entre los humanos y el ratón. Por ejemplo. La severidad de la
distrofia muscular que afecta a miles de niños contrasta con la
relativa suavidad de los síntomas en el ratón. Para explicar estas
discrepancias podemos mencionar que las diferencias observadas entre
el ratón y el hombre no deberían sorprendernos tanto, ya que las
variaciones de severidad intra-especie son relativamente comunes. Un
buen ejemplo de esto lo constituye la mutación ferroquelatasa
deficiente (Fechm1Pas), inducida por mutagénesis química, la cual
constituye un excelente modelo de la porfiria eritropoyética humana.
Esta mutación fue localizada en el cromosoma 18 e identificada como
una mutación puntual en el gen que codifica para la enzima
ferroquelatasa, cuya función es insertar una molécula de hierro
dentro de la molécula hemo. Cuando la mutación se encuentra en fondo
genético BALB/c, los ratones homocigotas Fechm1Pas/ Fechm1Pas
muestran ictericia, son muy sensibles a la luz y desarrollan una
cirrosis muy severa (a veces fatal). Sin embargo, cuando la misma
mutación se encuentra en otro fondo genético (por ej.: C57BL/6J),
exhibe un fenotipo mucho menos severo. Ejemplos como estos son muy
comunes entre los ratones, llegando al extremo de que algunos alelos
mutantes pueden ser dominantes en una cepa particular y recesivo en
otra17, 18. Bibliografía 1. Benavides F, Guénet JL. Mapeo de genes en el ratón. Medicina
(Buenos Aires) 1997; 57: 507-10. * Nótese que la nomenclatura para los genes humanos es siempre en
mayúscula y para el ratón sólo la primera letra en mayúscula
(ambos deben anotarse en letra cursiva). Las mutaciones recesivas se
anotan en minúscula y las dominantes llevan la primera letra en
mayúscula.
Nombre del gen Símbolo Modelo Enfermedad humana Adenomatous polyposis cell ApcMin Inducido químicamente, KO
Poliposis familiar, Tabla 1. Desórdenes de células derivadas de la cresta neural Nombre del gen Símbolo Modelo Enfermedad humana Endothelin 3 Edn3ls KO, Espontáneo Síndrome de Waardenburg-Shah Nombre del gen Símbolo Modelo Enfermedad humana Myosin VIIA Myo7ash1 Inducido químicamente, Espontáneo Síndrome
de Ushers tipo IB Tabla 3. Enfermedades de los huesos y el tejido conectivo Nombre del gen Símbolo Modelo Enfermedad humana Procollagen type 1, Cola1Mov13 KO, Inducido por radiación,
Transgénico Osteogénesis imperfecta; Ehlers-Danlos Tabla 4. Desórdenes neurológicos y neuromusculares Nombre del gen Símbolo Modelo Enfermedad humana Apolipoprotein E Apoeb KO Alzheimer tipo 2 Nombre del gen Símbolo Modelo Enfermedad humana Adenosine deaminase Ada KO Inmunodeficiencia combinada severa
(SCID) Nombre del gen Símbolo Modelo Enfermedad humana Apolipoprotein B Apob KO, Transgénico Hipolipoproteinemia
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