LA ACTIVACION DE LOS RECEPTORES A1 DE ADENOSINA ATENUA EL ATONTAMIENTO DE MIOCARDIO EN EL CONEJO

Martín Donato#, Celina Morales, VerOnica D’Annunzio, Omar ScapIn, Ricardo J. Gelpi*

Laboratorio de Fisiopatología Cardiovascular, Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires y Fundación Grupo de Estudios Multicéntricos en Argentina (GEMA), Buenos Aires

# Becario de ANPCyT (Agencia de Promoción Científica y Tecnológica)
* Miembro de la Carrera del Investigador del CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas)

Resumen

Los corazones expuestos a un período prolongado de isquemia (³ 30 minutos) presentan un menor tamaño de infarto cuando son reperfundidos en presencia de adenosina. Sin embargo, cuando el período de isquemia es menor, estas áreas de infarto son poco significativas, quedando en forma transitoria un cuadro de disfunción ventricular postisquémica. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de la adenosina, (administrada solamente en la reperfusión) sobre las alteraciones sistólicas y diastólicas presentes en la disfunción ventricular postisquémica así como también determinar sí en dicho efecto están involucrados los receptores A1. Corazones aislados e isovolúmicos de conejo, fueron sometidos a isquemia global de 15 minutos y reperfusión de 30 minutos. Durante la reperfusión se evaluó la función ventricular. En el grupo control, la presión desarrollada (PDVI) se recuperó hasta un 56±2% a los 30 minutos de la reperfusión, mientras que con la administración de adenosina alcanza un 75±3% (P<0.05 vs. control). Sin embargo, cuando se administró la adenosina junto con el bloqueante selectivo del receptor A1 (DPCPX) la PDVI alcanzó un 50±2% (P<0.05 vs. control). La presión diastólica final (PDFVI) (rigidez diastólica) en el grupo control, aumentó un 293±4%, a los 30 minutos de la reperfusión, mientras que con la administración de adenosina, la PDFVI alcanzó un 15±8% (P<0.05 vs. control). La reperfusión en presencia de adenosina más DPCPX no logró atenuar el aumento de la rigidez diastólica, alcanzando un 493±9 % (P<0.05 vs. control). La adenosina atenuó las alteraciones sistólicas y la rigidez diastólica de la disfunción postisquémica. Este efecto protector fue abolido por el bloqueante de los receptores A1, sugiriendo un rol de estos receptores en la protección inducida por adenosina.

Palabras clave:injuria por reperfusión, miocardio atontado, adenosina, función ventricular

Abstract

The activation of A1 adenosine receptors attenuates myocardial stunning in the rabbit. Hearts exposed to a prolonged period of ischemia (³ 30 minutes) present smaller infarct size when reperfused in the presence of adenosine. However, when the period of ischemia is shorter, the infarct areas are not very significant, but a postischemic ventricular dysfunction persists. The objective of this study was to determine the effect of adenosine, (administered only during reperfusion) on systolic and diastolic alterations present in postischemic ventricular dysfunction, as well as to determine whether A1 receptors participate in this effect. Isolated isovolumic rabbit hearts were subjected to 15 minutes of global ischemia followed by 30 minutes of reperfusion. Before ischemia and during reperfusion ventricular function was evaluated. In the control group, the left ventricular developed pressure (LVDP) reached 56 ± 2% of recovery at 30 minutes of reperfusion. The administration of adenosine improved LVDP 75 ± 3% (P<0.05 vs. control). However, when adenosine was given in presence of an A1 receptor selective antagonist (DPCPX), LVDP reached 50 ± 2% (P<0.05 vs. control). In the control group, left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) (diastolic stiffness), increased 293 ± 4%, at 30 minutes of reperfusion. Only a 15 ± 8% (P<0.05 vs. control) increase in LVEDP was observed with adenosine. Reperfusion with adenosine plus DPCPX did not attenuate an increase of 493 ± 9% (P<0.05 vs. control) in diastolic stiffness. Adenosine administered from the beginning of reperfusion attenuated both systolic alterations and diastolic stiffness in postischemic dysfunction. This effect was abolished by DPCPX, suggesting an important role for the A1 receptors in adenosine protection.

Key words:reperfusion injury, myocardial stunning, adenosine, ventricular function

Dirección postal: Dr. Ricardo J. Gelpi, Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Uriburu 950 - Piso 2, 1114 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54 11) 4962-4945 e-mail: rgelpi@fmed.uba.ar 

Recibido: 26-XII-2000 Aceptado: 13-VI-2001

El miocardio “atontado” puede ser definido como una disfunción ventricular postisquémica reversible sistólica y diastólica, y con reserva contráctil conservada1. Esta disfunción puede ser evidenciada tanto en el ámbito experimental como clínico1. En relación con esto, algunos trabajos experimentales2-4 demostraron que la disfunción ventricular puede ser atenuada realizando intervenciones farmacológicas antes del período de isquemia. Sin embargo, es de suma relevancia, para una potencial aplicación terapéutica, encontrar esta protección y conocer los mecanismos involucrados cuando se aplican procedimientos durante la reperfusión temprana.
La adenosina ha sido relacionada con un efecto protector sobre el daño producido por la isquemia y la posterior reperfusión en el corazón4. Así, Zhao y col.5 demostraron, en corazones de conejo crónicamente instrumentados, que la adenosina reduce el tamaño de infarto a través de la activación de los receptores A1, y que este efecto protector es ejercido principalmente durante la isquemia. De la misma manera, Olafsson y col.6, y Homeister y col.7 mostraron que la administración intracoronaria de adenosina durante la reperfusión temprana, en corazones de perros crónicamente instrumen-tados, disminuye el tamaño de infarto. Utilizando una especie con escasa circulación colateral, como el conejo, y un modelo de corazón aislado, Janier y col.8 encontraron mejoría en la función ventricular sistólica y diastólica cuando la adenosina fue dada durante todo el experimento, es decir, desde antes de la isquemia y hasta el final de la reperfusión, pero esta protección estuvo atenuada cuando la droga estuvo presente solamente en la reperfusión.
Por último, algunos autores9-10 mostraron que la adenosina, administrada sólo en la reperfusión, disminuye el tamaño de infarto y mejora la función sistólica por un incremento del flujo coronario, actuando sobre los receptores A2 vasculares.
Sin embargo, estas investigaciones5-10 utilizaron tiempos prolongados de isquemia, con infartos que comprometen gran porcentaje de la pared ventricular. Por otro lado, no han evaluado las alteraciones diastólicas de la disfunción postisquémica y existen discrepancias acerca de cual es el mecanismo de protección.
Sólo unos pocos estudios,11-14 utilizaron tiempos más cortos de isquemia (£15 minutos), pero los resultados obtenidos son contradictorios y además no han estudiado los mecanismos involucrados.
Trabajos clínicos han intentado detectar el efecto protector de la adenosina. Estos estudios fueron realizados en pacientes sometidos a terapia de reperfusión con trombolíticos15, angioplastia16, y además durante cirugía de revascularización17. Sin embargo, los resultados no son concluyentes.
De esta manera, el objetivo del presente trabajo fue detectar si el efecto protector de la adenosina sobre la disfunción ventricular postisquémica sistólica y diastólica incluye la participación de los receptores A1, como posibles mediadores de este efecto.
Hemos utilizado isquemia global lo que nos independiza de las complicaciones del uso de la isquemia regional, tales como la contracción ventricular asincrónica y la circulación colateral18. Otra ventaja de este modelo es la similitud del corazón de conejo con el corazón humano, en lo que respecta a la ausencia de la enzima xantina oxidasa19 y a la escasa circulación colateral,20 dos variables que pueden modificar la evolución de la enfermedad isquémica.

Material y métodos

Modelo experimental:

Se utilizaron conejos con un peso de 1.8 a 2.0 Kg, que se anestesiaron con tiopental sódico (35 mg/Kg) y ketamina (75 mg/Kg). Se abrió el tórax rápidamente y se aisló la arteria aorta, para luego colocar una cánula en la mencionada arteria. Una vez removido el corazón, se lo colocó en un sistema de perfusión según la técnica modificada de Langendorff.
El corazón fue perfundido con solución de Ringer, compuesta de la siguiente manera: ClNa 118 mM, Cl2Ca 2 mM, ClK 5.9 mM, SO4 Mg 1.2 mM, CO3HNa 20 mM y dextrosa 11.1 mM, la misma fue termostatizada a 36.5±0.03 º C y equilibrada con una mezcla de 95% O2 – 5% CO2, para obtener un pH de 7.45 ± 0.02. Se suturaron dos electrodos para estimular al corazón y así poder mantener la frecuencia cardíaca constante en un valor de 175 lat/min. El corazón se dejó estabilizar durante 20 minutos.
En el ventrículo izquierdo se colocó un balón de látex atado a uno de los extremos de un tubo rígido de polietileno, pasándolo por el anillo mitral a través de un ojal practicado en la orejuela izquierda. El otro extremo del tubo se conectó a un transductor de presión Deltram II (Utah Medical System), el cual nos permitió registrar la presión intraventricular izquierda. El globo de látex se llenó con solución acuosa hasta lograr una presión diastólica final del ventrículo izquierdo (PDFVI) de 8-12 mmHg, y se mantuvo este volumen constante durante todo el experimento. Considerando que la rigidez ventricular diastólica se expresa a través de la relación dP/dV, entonces, en el corazón isovolúmico la presión diastólica final es índice de rigidez ventricular.
También se registró la presión de perfusión coronaria (PPC) a través de otro transductor de presión conectado a la línea de perfusión. El flujo coronario, controlado con una bomba peristáltica, se reguló para conseguir una PPC de 74 ± 2 mmHg. Debido a que la resistencia vascular está definida por la relación entre la presión y el flujo, en un corazón perfundido a flujo coronario constante, la presión de perfusión coronaria indica la resistencia vascular coronaria.
La presión intraventricular izquierda y la PPC se registraron en una computadora PC con plaqueta conversora analógica-digital que permite registros en tiempo real. Se calculó la presión desarrollada del ventrículo izquierdo (PDVI), que se obtuvo restando la PDFVI a la presión ventricular sistólica pico. La fase de relajación fue evaluada utilizando la constante de tiempo de decaimiento de la presión ventricular durante la fase de relajación (t, Tau)21. Durante el período isquémico los corazones se mantuvieron en normotermia mediante inmersión en una cámara termostatizada conteniendo solución acuosa.
Protocolo experimental:

Se realizaron cinco grupos experimentales (Fig. 1).
Grupo 1(n=6): Este grupo se realizó con el objeto de verificar que la dosis de adenosina seleccionada (0.3 mg/kg/min) es suficiente para activar los receptores purinérgicos. Para esto se evaluó la respuesta inotrópica positiva a un bolo de isoproterenol (0.057 µg/kg) en ausencia y en presencia de adenosina.
Grupo 2 (n=4): Se realizó un segundo grupo con el objeto de verificar que la dosis seleccionada de DPCPX (200 nM) es suficiente para bloquear los receptores purinérgicos. Para verificar esto se evaluó la respuesta inotrópica positiva a un bolo de isoproterenol (0.057 µg/kg) en ausencia y en presencia de adenosina junto con DPCPX.
Grupo 3 (n=14): se indujo una disfunción ventricular postisquémica sistólica y diastólica (“miocardio atontado”) mediante un periodo de 15 minutos de isquemia seguido por 30 minutos de reperfusión. Se utilizó isquemia global, la cual fue inducida disminuyendo abruptamente el flujo coronario total aportado por la bomba de perfusión.
Grupo 4 (n=14): en este grupo de animales se repitió el protocolo del grupo 1, pero se agregó adenosina (0.3 mg/kg/min)4 a la solución de Ringer, desde el inicio de la reperfusión continuándose hasta el final de la misma.
Grupo 5 (n=10): se repitió el protocolo del grupo 1, pero se agregó adenosina (0.3 mg/kg/min) y DPCPX (200 nM), un bloqueante selectivo de los receptores A1, desde el inicio de la reperfusión continuándose hasta el final de la misma.

Análisis estadístico: Los resultados fueron expresados como la media ± error standard (ES) y los datos se analizaron por análisis de varianza seguido por la prueba de Bonferroni para comparaciones múltiples. Se consideró una diferencia significativa cuando el valor de p fue menor de 0.05.

Resultados

En la Tabla 1 se observa la respuesta inotrópica positiva a un bolo de isoproterenol (0.057 µg/kg) en ausencia y en presencia de adenosina, y durante la administración de DPCPX (200 nM). Se puede observar que la respuesta inotrópica positiva al agonista ß, evaluada a través de la presión desarrollada, se encuentra disminuida cuando el isoproterenol es administrado en presencia del nucleósido. Dado que la adenosina atenúa la actividad de la enzima adenilciclasa, y que por el contrario el isoproterenol tiene la capacidad de estimularla, estos datos demuestran que la dosis de adenosina seleccionada es suficiente para activar al receptor A1. De la misma manera, la falta de atenuación a la respuesta inotrópica positiva provocada por un nuevo bolo de isoproterenol, esta vez en presencia de adenosina y DPCPX, sugiere que la dosis del bloqueante A1 seleccionada es suficiente para impedir la activación del receptor de adenosina.
Los datos promedios de la presión desarrollada del ventrículo izquierdo (PDVI), se observan en la Fig. 2. En el grupo control, sin intervención farmacológica, la presión desarrollada se recupera durante la reperfusión hasta un 59±0.1% a los 15 minutos, alcanzando un 56±2% a los 30 minutos de la reperfusión. Con la administración de adenosina al comienzo de la reperfusión el valor de la presión desarrollada a los 15 y 30 minutos de la reperfusión fue de 76±7% (p<0.05 vs. grupo control) y 75±3% (p<0.05 vs. grupo control), con respecto a su valor control. Sin embargo, cuando se administró la adenosina junto con el bloqueante selectivo del receptor A1 (DPCPX) la presión desarrollada alcanzó un 49±9% (p<0.05 vs. grupo control), y un 50±2% (p<0.05 vs. grupo control) a los 15 y 30 minutos del mencionado período, respectivamente. Como se observa, la adenosina administrada desde el inicio de la reperfusión atenuó la disfunción postisquémica sistólica, y dicha protección fue abolida con la administración de DPCPX.
En la Fig. 3 se puede observar el comportamiento de la presión diastólica final (panel superior) y de la presión de perfusión coronaria (panel inferior). Se observa que, en el grupo control, la PDFVI aumentó un 293±4%, a los 30 minutos del mencionado período. Con la administración de adenosina desde el comienzo de la reperfusión, la presión diastólica final no aumentó significativamente, alcanzando un 15±8% (p<0.05 vs. grupo control) a los 30 minutos. La reperfusión en presencia de adenosina más DPCPX no logró atenuar el aumento de la rigidez diastólica, alcanzando a los 30 minutos del mencionado período un 493±9% (p<0.05 vs grupo control y grupo con adenosina). La PPC, en el grupo control, inmediatamente después del período de isquemia, comienza a elevarse progresivamente hasta alcanzar un 127.4±3% a los 30 minutos del período de reperfusión. En el grupo que recibió el nucleósido desde el inicio de la reperfusión, se observa la caída de la presión de perfusión coronaria, hasta un 75±4%, al minuto del mencionado período y, luego de 30 minutos de reperfusión alcanzó un 91±6%. El grupo tratado con el bloqueante A1 mostró un comportamiento similar al miocardio atontado alcanzando un 124±6%, hacia los 30 minutos de la reperfusión.
El análisis de la relajación isovolúmica mostró que en el grupo con disfunción postisquémica hay un enlentecimiento transitorio de la velocidad de relajación al principio de la reperfusión que se refleja en un aumento de los valores de la constante de tiempo de caída de la presión (t) desde 27±1 mseg en situación control hasta 52±7 mseg, al minuto de la reperfusión, para normalizarse progresivamente durante el transcurso del mencionado período. La administración de adenosina ya sea sola o en combinación con DPCPX no modificó las alteraciones de esta fase de la diástole.

Discusión

En el presente trabajo se muestra evidencia experimental de que la administración de adenosina exógena, desde el inicio de la reperfusión, en un modelo de corazón aislado con isquemia global, protege al miocardio de las alteraciones sistólicas y del aumento de la rigidez diastólica presentes en la disfunción postisquémica. Esta protección fue atenuada cuando la adenosina se administró conjuntamente con un bloqueante de los receptores A1 de adenosina, sugiriendo la participación de los mencionados receptores en esta protección. Sin embargo, la adenosina no mejoró las alteraciones del componente activo diastólico evaluado a través de la relajación isovolúmica. La administración del bloqueante selectivo de los receptores A1, además de eliminar el efecto protector de la adenosina, deprimió el estado contráctil por debajo de los valores del grupo control. Esto está de acuerdo con los hallazgos previos de Zhao y col.,5 quienes demostraron la importancia de la adenosina endógena en la modulación del daño producido por la isquemia. Además, un trabajo reciente de Peart y col.13 en el que se administró solamente DPCPX en la reperfusión en un modelo de corazón aislado de ratón muestra resultados similares a los nuestros. Sin embargo, estos autores evaluaron sólo los efectos de la adenosina endógena, sin administración exógena de la droga y en una especie diferente.
Si bien varios estudios previos5-8 pusieron en evidencia el efecto protector de la adenosina sobre el daño isquémico cuando es administrada en la reperfusión, el nuestro extiende ese concepto de protección en varios aspectos importantes.
En primer lugar, la mayoría de los trabajos5-7 utilizaron modelos de isquemia regional, en donde el estado contráctil puede ser influenciado por la presencia de circulación colateral y por la contracción ventricular asincrónica22. Además, si la isquemia regional es provocada en organismos intactos, la función sistólica es modificada también por variaciones en la pre y la poscarga. Por lo tanto, la administración de adenosina, puede provocar una mejoría de los parámetros eyectivos, debido a una disminución de la poscarga en lugar de un efecto directo sobre el miocardio. Otra variable a considerar en estos modelos es que los cambios en las condiciones de carga del corazón disminuyen el consumo de oxígeno y por lo tanto mejoran la relación aporte-demanda durante la isquemia. Al utilizar, en nuestro estudio, un modelo de corazón aislado e isovolúmico, con isquemia global y flujo coronario constante eliminamos la influencia de los factores mencionados.
En segundo lugar, analizamos los dos componentes de la fase diastólica: la relajación isovolúmica y la rigidez ventricular. Es conocido que en la disfunción postisquémica existe durante la reperfusión una alteración de las dos fases de la diástole23 que se manifiesta según evaluemos la reperfusión precoz o tardía: mientras que en la reperfusión precoz existe un enlenteci-miento transitorio de la relajación que se normaliza en función del tiempo, en la reperfusión tardía se observa un marcado aumento de la rigidez ventricular pero con relajación normal. Es interesante observar que la adenosina atenuó el aumento de la rigidez ventricular diastólica, pero no modificó las alteraciones tempranas de la relajación isovolúmica. En nuestro conocimiento un solo trabajo8 mostró mejoría del estado contráctil y atenuación del aumento de la rigidez diastólica durante la reperfusión, en un modelo de corazón aislado e isovolúmico, administrando la adenosina antes, durante y después del período de isquemia. Sin embargo, la protección encontrada, cuando la intervención se realizó solamente en la reperfusión, fue menor. Además, utilizaron un tiempo prolongado de isquemia (30 minutos) por lo que es válido pensar que la adenosina actuó disminuyendo el tamaño de infarto, y de esta manera indirectamente mejoró la función ventricular.
Una tercera diferencia con trabajos previos5-10 es el tiempo de isquemia utilizado. Algunos autores usaron tiempos prolongados (³ 30 minutos), donde existen áreas de infarto que comprometen gran porcentaje de la pared ventricular. Nosotros, hemos utilizado un modelo experimental con 15 minutos de isquemia global, en donde el tamaño de infarto es poco significativo. En nuestro conocimiento solo dos trabajos11-12 utilizaron tiempos cortos de isquemia, y administraron, en la reperfusión, adenosina exógena y una agonista selectivo A1, respectivamente. Sin embargo, estos estudios, que no encontraron protección, utilizaron una especie diferente como el perro, y un modelo de isquemia regional, que como ya ha sido mencionado dificulta la evaluación de la función ventricular. En un trabajo previo de nuestro laboratorio,14 mostramos el efecto protector de la adenosina administrada en la reperfusión, pero no estudiamos los mecanismos involucrados. Son varios los mecanismos que se pueden postular para explicar el efecto protector de la adenosina durante la reperfusión. En primer lugar, algunos autores9-10 sugieren la posibilidad de que la adenosina mejore la función sistólica por un incremento del flujo coronario, actuando sobre los receptores A2 vasculares, (“fenómeno de Gregg”). Este no sería el caso en nuestro modelo experimental, debido a que nosotros trabajamos con flujo coronario constante y por otro lado cuando bloqueamos el receptor A1 de adenosina durante la reperfusión el efecto protector desapareció, por lo tanto este receptor jugaría un rol clave en el mecanismo intrínseco de la protección mediada por adenosina. En segundo lugar, es conocido que la reperfusión provoca un significativo deterioro de la respuesta vasodilatadora en el lecho previamente isquémico, con liberación de endotelinas, una de las más potentes sustancias vasoconstrictoras, que tendrían un importante rol en la reducción del flujo sanguíneo24. Velasco y col.25 describieron que la adenosina puede disminuir durante la reperfusión temprana, la liberación de endotelinas contribuyendo a mejorar la función ventricular. Por último, es conocido que el precondicionamiento isquémico involucra una serie de acontecimientos intracelulares preisquémicos que, se inician con la activación del receptor A1 y que tienen como uno de sus efectores finales a los canales de K+ ATP sensibles de la mitocondria26. Si bien la participación de este mecanismo específico durante la reperfusión no ha sido estudiada, nuestros datos sugieren que por lo menos el paso inicial de esta forma de protección está presente cuando la adenosina es administrada tempranamente en la reperfusión.
En resumen, hemos mostrado en un modelo experimental con estricto control de variables e isquemia global, que la administración de adenosina, durante la reperfusión, protege al miocardio de las alteraciones postisquémicas sistólicas y del aumento de la rigidez diastólica, sin modificar la relajación isovolúmica. Esta protección, que incluye el estado contráctil y la rigidez diastólica, está directamente relacionada con la activación de los receptores A1 purinérgicos. Si bien la extrapolación de datos obtenidos en animales de experimentación a pacientes debe ser realizado con extrema cautela, el hecho de que la administración de la adenosina posterior al período de isquemia tenga un efecto protector, podría representar una interesante propuesta terapéutica. Sin embargo, se deben considerar sus efectos hipotensores debidos a la activación del receptor A2, la fugacidad de la acción de este compuesto y la aparición de tolerancia cuando es administrado en forma crónica27.

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Tabla 1.– Efecto de un bolo de isoproterenol en presencia y en ausencia de adenosina (G1) y durante la administración de DPCPX (G2), sobre la presión desarrollada del ventrículo izquierdo (PDVI). *: p<0.05 vs control. G1: Grupo 1; G2: Grupo 2

G1 Control Isoproterenol Isoproterenol +
adenosina

PDVI (%) 100 133±5* 112±6
G2 Control Isoproterenol Isoproterenol +
adenosina + DPCPX
PDVI (%) 100 129±10* 134±9*

Fig. 2.– Se representan los valores de presión desarrollada del ventrículo izquierdo (PDVI), en los tres grupos estudiados, en situación control y durante 30 minutos de reperfusión, después de 15 minutos de isquemia; obsérvese que la adenosina atenuó las alteraciones sistólicas de la disfunción postisquémica. Este efecto fue abolido con la administración de DPCPX. *: p< 0,05 vs control

Fig. 3.– Se muestran los valores de presión diastólica final del ventrículo izquierdo (PDFVI) (panel superior) y de la presión de perfusión coronaria (PPC) (panel inferior), en los tres grupos estudiados, en situación control y durante 30 minutos de reperfusión, después de 15 minutos de isquemia, se observa que la adenosina atenuó el aumento de la rigidez diastólica, y de la presión de perfusión coronaria. *: p< 0.05 vs control.