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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES EN POSTER INMUNOLOGIA VII 300. Caracterización de un panel de anticuerpos monoclonales
anti-rhEPO. María L. Zenclussen(1), Marcos R. Oggero Eberhardt(1),
Ricardo B. Kratje(1), Marina Etche-verrigaray(1). El presente trabajo muestra la caracterización de un panel de cinco anticuerpos monoclonales (MAbs) anti-Eritropoyetina humana recombinante (rh-EPO). En una primera etapa estudiamos las características cinéticas y metabólicas del crecimiento de hibridomas en un cultivo batch estático durante 12 días con el objeto de evaluar las condiciones óptimas de producción de MAbs. Mediante SDS-PAGE y Western Blot observamos la secreción de fragmentos de inmunoglobulinas y anticuerpos completos en etapas tempranas del cultivo, existiendo en días posteriores una adaptación de los hibridomas para producir predominantemente las formas moleculares completas. Por otro lado, la afinidad de las inmunoglobulinas no demostró variaciones significativas durante el cultivo, conservándose aún en la fase de muerte celular cuando las condiciones del medio no son apropiadas para su estabilidad.Luego de establecer las condiciones óptimas de cultivo evaluamos desde el punto de vista inmunoquímico la capacidad de cada MAb para interaccionar con rhEPO empleando diversas técnicas: SDS-PAGE nativo y desnaturalizante, isoelectroenfoque, Western Blot y ELISA. Los mencionados estudios demostraron la diferente capacidad de reconocimiento de rhEPO por parte de los MAbs, permitiendo seleccionar aquéllos más apropiados para diferentes propósitos tales como el estudio del perfil de isoformas glicosídicas de rhEPO, su purificación por técnicas de inmunoafinidad y el diseño de métodos de ELISA, entre otros. 301. La aglutinación de granulocitos inducida por el Mab murino
anti-Lewis FC-2.15 está mediada por la activación de b2-integrinas y
por la formación de complejos inmunes que involucran epitopes
alfa-gal. Mariana I. Capurro(1), Cynthia López Haber(1), Marcela
Barrio(1), Laura Bover(1), José Mordoh(1). El anticuerpo monoclonal (Mab) murino FC-2.15 reconoce LewisX (LeX), presente en granulocitos humanos (PMN). Patológicamente, LeX se expresa en tumores epiteliales. FC-2.15 media la lisis de células LeX+ vía fijación de complemento (C´), e induce la aglutinación homotípica de PMN tanto in vitro como en SCSEV (sistema de circulación sanguínea ex vivo). Dicha aglutinación no se modificó por baja temperatura, 2-deoxiglucosa, iodoacetamida o azida sódica pero la fijación con formaldehído la inhibió completamente, sugiriendo que se trata de un proceso conformacional. Los siguientes resultados sugieren un rol para la b2-integrina (CD11b/CD18) en la aglutinación de PMN inducida por FC-2.15: 1) la aglutinación inducida por fMLP, por Mab KIM185 (activador de anti-b2- integrina) y FC-2.15 mostró requerimientos similares; 2) la preincubación con Mab TS1/18 (bloqueante de b2-integrina), inhibió significativamente el proceso; 3) el monómero CD18 de la b2-integrina posee residuos LeX. Los Mabs murinos pueden contener residuos a-gal. La ausencia de alfa1-3 galactosil-transferasa en el hombre, hace que a-gal sea altamente immunogénico y que el suero humano contenga grandes cantidades de anti-a-gal Abs. Hemos demostrado que FC-2.15 contiene residuos a-gal, los cuales pueden eliminarse con alfa-galactosidasa, sin afectar la capacidad lítica de FC-2.15 (PMN o células MCF-7) y que la formación de complejos inmunes anti-a-gal Abs-FC.2.15 también contribuye a la aglutinación de PMN en SCSEV. 302. A new method for measuring ANTI-dsDNA reactivity in soluble
phase and different ionic strenght conditions. Laura M. Zarebski(1),
Ana M. Di Lonardo(2), Nestor H. Coraggio(2), Fernando A. Goldbaum(1),
Orlando G. Carballo(2). The standard technique for Anti-dsDNA detection is Immunofluorescence(IF) in Crithidia. It is highly specific but detects both high and low affinity autoantibodies, of which only the high-affinity subpopulation is considered to be pathogenic. The Farr assay detects this subgroup at high ionic strength and may thus be the most useful test in the follow-up of the disease. However, it is difficult to apply routinely at the laboratory. We have developed a novel soluble-phase ELISA that is highly sensitive and specific to anti-dsDNA antibodies. In this method, sera from patients are analyzed at physiological salt concentrations, and those who render positive results are further analyzed using higher salt concentrations. We have tested sera from SLE patients that were either positive or negative in IF Crithidia assay. Out of 16 positive sera, all were also positive in our assay at physiological salt concentration, and most of them remained positive at 1M NaCl. Out of 17 negative IF sera, 8 were confirmed as negative, while 9 of them developed positive signals. This reactivity was abrogated at 1M NaCl in 8 of these 9 sera, indicating that it is sensitive to higher ionic strength. We tested the specificity of the assay with sera from patients of other systemic autoimmune diseases(10 CREST, 10 AR, 1 CMTD). All of them were negative in our soluble ELISA at 0.15 M NaCl. This new method shows promising results regarding to sensitivity, specificity and feasibility in the diagnosis of SLE. 303. Impacto de la acidosis extracelular sobre la capacidad de
células dendríticas de inducir una respuesta inmune humoral. Mónica
Vermeulen(1), Mirta Giordano(2), Paula Fernández Calotti(2), Romina
Gamberale(2), Karen Nahmod(2), Analía Trevani(2), Jorge Geffner(2). Examinamos de qué modo la acidosis extracelular afecta la fisiología de las células dendríticas. Para ello células dendríticas inmaduras obtenidas de precursores de médula ósea de ratones BALB/c se incubaron con peroxidasa de rábano (150 ug/ml) por 20 min a 37oC, a pH 7.3 o 6.7. Observamos que los niveles de endocitosis, evaluados a través de un ensayo colorimétrico, fueron mayores a pH acídico: densidad óptica a 492 nm (DO) 0.30 ± 0.05 vs 0.70 ± 0.04 (pH 7.3 vs 6.7, media ± ES, n=5, p<0.05). Por otra parte, células dendríticas pulsadas con ovalbúmina (OVA 50 ug/ml) por 18 hs a 37oC, a pH 7.3 o 6.7, se transfirieron (3 x105 ) por vía endovenosa a ratones singeneicos vírgenes, evaluándose al cabo de dos semanas la producción de anticuerpos específicos por ELISA. Los resultados obtenidos demuestran que la inmunización con células dendríticas pulsadas a pH acídico indujo mayores niveles de anticuerpos anti-OVA respecto de lo observado para células dendríticas pulsadas a pH neutro: DO = 0.50± 0.01 vs 1.10 ± 0.04, media ± ES, n=10, p < 0.05, correspondiente a la valoración total de anticuerpos IgM + IgG en una dilución 1/50 del suero. Para todos los isotipos evaluados (IgM, IgG1, IgG2a e IgE) se observaron incrementos significativos en los niveles de anticuerpos específicos (p < 0.01). Los resultados obtenidos sugieren que el encuentro del antígeno con las células dendríticas en un microambiente acídico favorece la generación de la respuesta inmune humoral. 304. El TNF-alfa retarda la apoptosis de células neoplásicas
en leucemia mieloide aguda. Gabriela Salamone(1), Karen Nahmod,
Analía Trevani, Mónica Vermeulen, María C. Salamone, Mirta
Giordano, Jorge Geffner. Previamente demostramos que el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) promovía la apoptosis de granulocitos neutrófilos. Aquí, examinamos su efecto sobre la apoptosis de células leucémicas provenientes de pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA). Las células mononucleares fueron purificadas por gradientes de Ficoll-Hypaque a partir de muestras de sangre periférica o médula ósea, provenientes de pacientes no tratados, con porcentajes de blastos superiores al 50%. La apoptosis fue evaluada por microscopía de fluorescencia o citometría de flujo (test de anexina V) durante un período de 5 días. Los resultados presentados corresponden al día en el cual las células no tratadas con TNF-alfa mostraron niveles de apoptosis superiores al 30%. Encontramos, en todas las muestras ensayadas, que el TNF-alfa (10 ng/ml) ejerció una notoria prevención sobre la apoptosis espontánea: % supresión de la apoptosis, 74 ± 17 (n=11, p < 0.001). Observamos, además, que el TNF-alfa ejerció también un notorio efecto preventivo en aquellos cultivos realizados en presencia de Idarubicina o Etopósido (1 ug/ml), agentes que promueven la apoptosis de células leucémicas mieloides: % supresión de la apoptosis, 75 ± 18 y 72 ± 8, respectivamente (n=6-7, p < 0.001). Los resultados presentados indican que, en contraste con las observaciones realizadas en neutrófilos normales, las células leucémicas de pacientes con LMA son rescatadas de la apoptosis por efecto del TNF-alfa. 305. Receptores de tipo Toll en la infección por el virus del
tumor mamario murino. Dalia Burzyn(1), Paula Berguer(1), Pedro
Bekinschtein(1), Virginia Francisco(1), Mariana Graciarena(2), Irene
Nepomnaschy(2), Isabel Piazzon(2). El virus del tumor mamario murino (MMTV) activa e infecta inicialmente células B. Recientemente se ha demostrado que la envoltura del MMTV es capaz de unirse y señalizar a través de los receptores tipo Toll (TLRs) 2 y 4. Para estudiar el rol de los TLRs en la activación temprana de células B por MMTV, tolerizamos ratones BALB/c durante 3 días por vía sc con lipopolisacárido (LPS) de E.coli (2 ug/día) o peptidoglicano (PGN) de S.aureus (5 ug/día), induciendo hiporespuesta a estos ligandos de los TLRs. Inoculamos el virus en la almohadilla plantar de ratones a) no tolerizados, b) tolerizados con LPS y c) tolerizados con PGN. A las 24hs analizamos por citofluorometría la expresión del marcador de activación temprana CD69 en células B del ganglio linfático drenante. Los resultados se expresan como media del porcentaje de células CD69+B220+/B220+ ± SD (n=4): (a) 54,2 ± 18,2; (b) 23,8 ± 3,1 (p<0,05); (c) 22,0 ± 0,8 (p<0,05); ratones no inoculados con MMTV: 15,71 ± 5,43. Obtuvimos resultados similares utilizando la variante viral TBLV, que posee el gen sag delecionado, lo que descarta la participación del superantígeno en la activación de las células B. Analizamos además el nivel de integración viral (PCR semicuantitativo) en el ganglio drenante y observamos una disminución de la integración en los ratones tolerizados con LPS o PGN con respecto a los no tolerizados. Los resultados obtenidos sugieren que los TLRs podrían jugar un rol en las etapas tempranas de la infección por MMTV. 306. Células T reactivas al superantígeno en la glándula
mamaria de ratones infectados con el virus del tumor mamario murino.
Paula Berguer(1), Pedro Bekinschtein(1), Dalia Burzyn(1), Gabriela
Lombardi(1), Carla Piazzon(2), Isabel Piazzon(2), Irene
Nepomnaschy(2). El virus del tumor mamario murino ( MMTV) se transmite por leche y es transportado al epitelio mamario por linfocitos. En los primeros días de vida, las células B de las placas de Peyer son infectadas y presentan el superantígeno (Sag) codificado por el MMTV a las células T Vbeta (Vb) específicas. Los linfocitos B infectados y las células T reactivas proliferan, aumentando así la carga viral. Las células T reactivas al Sag sufren luego una progresiva deleción clonal. Se investigó la cinética de activación y deleción de dichas células en órganos linfoideos (por ej: ganglio (G) y bazo (B)) y en la glándula mamaria (GM) por técnicas citofluorométricas. Los porcentajes de células T Vb6+ CD4+/CD4+ a los 15, 30 y 40 días de vida en ratones no infectados se mantuvieron constantes en los órganos estudiados (rango 10.5- 12.3%); en los ratones infectados con MMTV(LA) los valores fueron (media+ES(n=3 experimentos)): 15días: G) 5.4+ 0.5, B) 4.4+ 0.6 y GM) 11.3+ 1.1; 30 días: G)1.2+ 0.6, B) 1.8+ 0.8 y GM) 8.1+ 0.6; 40 días:G) 0.98+ 0.7, B) 1.5+ 0.3 y GM) 3.9+ 0.5. En los ratones infectados la expresión de CD44 y de la integrina beta1 aumentó al día 15 en las células CD4+Vb6+/CD4+ en B y G, mientras que en la GM la activación se hace significativa al día 30. Estos resultados indican un retardo significativo en la cinética de activación y deleción de las células reactivas al Sag en la GM. Se discute el rol de estas poblaciones linfoides en GM en la infección del epitelio mamario. 307. Meliacina, un antiviral de amplio espectro de origen
vegetal, induce la producción de TNF alfa en macrófagos peritoneales
murinos. Erina Petrera(1), Celia E. Coto(1). Meliacina (Ma) es un antiviral obtenido de las hojas del árbol
M.azedarach L. Ma inhibe la encefalitis por virus Tacaribe en ratones
neonatos y la queratitis herpética estromal en adultos. Como en la
patología de estas infecciones participa el sistema inmune, quisimos
conocer si Ma actúa como agente in- munomodulador. Para ello
estudiamos su efecto sobre la producción de TNF alfa en macrófagos
murinos inducidos por LPS in-vitro. Macrófagos peritonea les de
ratones BALB/c hembras de 6 semanas de edad se sembraron en
microplacas de 24 pocillos (9 x 105 cél./pozo) con medio IMDM más
10% SFB. A las 24 hs de incubación a 37° C con 4% de CO2, los
cultivos se la- varon e indujeron con 3 microgr.de LPS y los
sobrenadantes se cosecharon a las 24 h. La actividad de TNF se midió
por su acción citolítica sobre cél L (tratadas con Actin. D).
Después de 24 h de incubar a 39° C se fijaron y colorearon con
cristal violeta, la conc. del colorante se midió a 590 nm. La
especificidad del TNF se determinó por neutralización con un
monoclonal anti-TNF. Los resultados obtenidos fueron: a) el
tratamiento con 50 ng de Ma sola no indujo TNF. b) el pretratamiento
con Ma a las 24, 2 y 1h antes del LPS no alteró el nivel de
producción de TNF. c) La inducción simultánea con LPS y Ma aumentó
en 2 log. la conc.de TNF. d) ese efecto fue Ma conc dependiente.e) el
TNF aparece a las 2h, el máximo es a las 4h manteniéndo- se hasta
las 24h. Estos datos indican que Ma sinergiza el efecto inductor del
LPS. 308. Oxido Nítrico y la respuesta inmune humoral hacia
antígenos administrados por via intranasal. Gisela Gamba(1), Ernesto
J. Massouh(1), Fabián Benencia(1). Se estudió el efecto de la aminoguanidina (AG, un inhibidor de la iNOS) sobre la respuesta inmune en mucosa pulmonar hacia la administración intranasal de ovoalbúmina (OVA) y toxina colérica (CT). Grupos de 10 ratones Balb/c se inocularon intranasalmente (día 0) con 10 µl de una solución de 10 mg de OVA y 1 µg de TC en PBS. A distintos días p.i se extrajeron turbinatos nasales y pulmones y por RT-PCR se observó que al día 2 p.i. se producía la activación de la iNOS mientras que en el día 5 p.i. se registraron muestras positivas para iNOS en pulmones. Grupos de 10 ratones se inocularon del día -2 al + 2 por via intranasal con 10 ul de PBS (control) o distintas cantidades de AG (7.5, 2 y 0.5 mg/raton) en PBS. En turbinatos nasales y pulmones se observó un aumento en la expresión de TNF-alfa en los ratones tratados. A distintos días post-inmunización (pi) se obtuvieron los sueros y se titularon. Se observó un aumento específico de anticuerpos anti-OVA del tipo IgG en los ratones tratados. Mediante un ELISA de captura específico para OVA se determinó que dicho aumento no se debía a un mayor travasamiento del antígeno hacia el suero como producto del tratamiento con AG. Resultados similares se obtuvieron al titular anticuerpos anti-TC en suero mientras que no se registraron diferencias en animales inmunizados sólo con OVA. En este modelo, la inhibición de la iNOS potencia el efecto adyuvante de la TC a nivel de la mucosa pulmonar sobre la respuesta inmune humoral hacia OVA. 309. Unión del componente C9 del complemento (C) a la
espectrina del citoesqueleto eritrocitario. Cintia K. Notcovich(1),
Adriana M. Almará(2). El objetivo de este trabajo fue evaluar la interacción del componente C9 del C humano con la espectrina del citoesqueleto eritrocitario. Se utilizaron eritrocitos de carnero sensibilizados con anticuerpos (EA) y se obtuvieron membranas por lisis con bajas dosis (1-2 UCH50) o con exceso de C (>5 UCH50), y por incubación en medio hipotónico de EA tratados con dosis sublíticas de C (EAC) o con suero inactivado (control). El análisis por SDS-PAGE de las membranas de EA lisados por exceso de C indicó la presencia de una banda intensa de 70 kDa de peso molecular (coincidente con el de C9 monomérico), no detectable en membranas de EAC o del control. Una banda tenue del mismo tamaño también fue observada en membranas de EA lisados por bajas dosis de C. En la electroinmunotransferencia con anti-C9, tanto las membranas de EA lisados por C como las provenientes de EAC mostraron una banda reactiva asignable a C9 monomérico, cuya intensidad se correspondió con la dosis de C utilizada. Además, las membranas de EA lisados por exceso de C mostraron dos bandas reactivas con anti-C9 a la altura de las subunidades alfa y beta de espectrina, que no se observaron en membranas obtenidas de EA lisados por bajas dosis de C, de EAC o del control. Los resultados obtenidos sugieren que, en condiciones de exceso de C, se produce una interacción entre C9 y la espectrina del citoesqueleto eritrocitario. Esta unión podría tener implicancia en el mecanismo de hemólisis intravascular mediada por C. 310. Inhibición de la actividad hemolítica del complemento (C)
por bilirrubina no conjugada (BNC) ‘in vivo’. Sandra M.
Arriaga(1), Adriana M. Almará(2), Aldo D. Mottino(3). En este trabajo se evaluó la capacidad de BNC para atenuar una reacción hemolítica aguda C-dependiente provocada por una transfusión de eritrocitos heterólogos. Cuatro grupos de ratas Wistar (n=3), con anticuerpos hemolíticos naturales contra eritrocitos de carnero (GRc), se trataron por vía endovenosa con una infusión de concentraciones crecientes de BNC (grupos B1-B4). El grupo control recibió NaCl 150 mM (n=4). Después de 10 min, los animales recibieron una inyección única de 0,5 ml de GRc al 40% por la misma vía. A los 30 min se analizó la concentración del pigmento alcanzada en plasma y se evaluó la hemólisis por C cuantificando la hemoglobina en orina. La hemoglobinuria fue confirmada analizando los uroproteinogramas correspondientes. Los valores de BNC (mg/dl) fueron: control= no detectable; B1=0,9±0,3; B2=2,7±0,4; B3=4,7±0,4; B4=17,8±0,5. Los resultados de hemoglobina en orina (g/dl) fueron: control= 3,3±0,9; B1=1,8±0,3*; B2=0,5±0,4*; B3=0,5±0,3*; B4=0,1±0,1*; (*) p<0,05 vs control. Los uroproteinogramas del grupo control revelaron la presencia de una zona difusa de marcada intensidad con movilidad beta asignable a hemoglobina. En los animales tratados con BNC la intensidad de esta zona decreció en correspondencia con el aumento de la concentración del pigmento en plasma. Se concluye que BNC atenúa la capacidad hemolítica del C ‘in vivo’. Este efecto anticomplementario del pigmento le asignaría un rol protector en las reacciones hemolíticas mediadas por C. 311. Prevención de la apoptosis de eosinófilos humanos por
plaquetas. Silvina Raiden(1), Jorge Schettini(1), Karen Nahmod(1),
Romina Gamberale(1), Mirta Giordano(1), Jorge Geffner(1). La identificación de aquellos factores capaces de modular la sobrevida de los granulocitos eosinófilos (E) resulta un área de potencial interés dada su prominente participación en los fenómenos alérgicos. Aquí, examinamos la capacidad de las plaquetas (P) de modular la apoptosis de E humanos. Las P y E fueron purificados por técnicas convencionales y la apoptosis evaluada por microscopía de fluorescencia. Encontramos que las P lavadas previnieron la apoptosis de los E: % de apoptosis = 33 ± 4, 58 ± 5 y 85 ± 7 vs 4 ± 2, 7 ± 2 y 17 ± 4, para E incubados durante 24, 48 y 72 hs, en ausencia y presencia de P (relación E: P: 1: 10), respectivamente (media ± ES, n = 7-11, p < 0.001). Este fenómeno no requerió del contacto P-E, ya que observamos niveles similares de prevención en sistemas ‘transwells’, donde E y P se hallan separados a través de una membrana permeable: % apoptosis a las 48 hs de cultivo, 69 ± 8 y 15 ± 6, para E cultivados en ausencia o presencia de P (relación 1:10) (n=4, p < 0.01). La prevención en la apoptosis de los E se asoció a una expresión disminuída de Fas, evaluada por citometría de flujo: intesidad media de fluorescencia 1566 ± 311 vs 434 ± 128, para E cultivados por 48 hs en ausencia y presencia de P (relación 1:10), respectivamente (n=4, p < 0.01). Los resultados presentados indican que productos liberados por plaquetas, aún no identificados, previenen notoriamente la apoptosis de los granulocitos eosinófilos. 312. Los leucocitos polimorfonucleares disminuyen la capacidad
inmunoestimuladora de las células dendríticas. Sandra I.
Zittermann(1), Maria L. Scimone(1), Paulo C. Maffia(1), Carolina C.
Jancic(1), Viviana P. Lutzky(1), Leonardo Fainboim(1), Eduardo H.
Chuluyan(1). Las células dendríticas (CDs) producen factores quimiotácticos capaces de reclutar leucocitos polimorfonucleares (PMNL). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de los PMNL de modular la fisiología de las CDs. Utilizando CDs humanas (generadas a partir de monocitos en presencia de IL-4 y GM-CSF) analizamos el efecto de los PMNL o de sus medios condicionados (MC) sobre las CDs examinando: i) la capacidad de estimulación de linfocitos T (LT); ii) la expresión de moléculas de superficie; iii) la capacidad endocítica; y iv) la producción de citoquinas. Las CDs tratadas con los MC mostraron una menor capacidad aloestimuladora de LT (42 ± 14%, n: 8, p< 0.05) comparadas con el control. Esta menor proliferación se correlacionó con una menor concentración de IFNg en los cultivos (781±3 pg/ml vs. 343±178 pg/ml, CDs vs. CDs tratadas, p<0.05). La incubación de las CDs con los PMNL disminuyó (11-46%) la expresión de MHC-clase I y II, CD40, CD86, CD18 y CD54 y la capacidad endocítica de las CDs (51%). La producción de TGFb, pero no IL-12, se vio aumentada tanto en su ARNm (74%) como en la proteína secretada (>100%). El rol de TGFb en la inhibición de la capacidad inmunoestimuladora fue confirmada bloqueando el efecto con un anticuerpo específico para esta citoquina. Estos resultados sugieren que los PMNL podrían modular la actividad de las CDs, induciendo una mayor producción de TGFb en las CDs. 313. Deficiencia hereditaria de Factor I. Hallazgos
inmunológicos en una familia. María M. Caram(1), Alejandra
Ginaca(1), Eva M. Rivas(1). La deficiencia de factor I del complemento es una enfermedad autosómica recesiva caracterizada por una incontrolada activación de la vía alterna, con consumo de C3 y factor B y una mayor susceptibilidad a infecciones producidas principalmente por Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis.Describimos un paciente de 5 años de edad, con historia de infecciones: otitis media aguda supuradas, celulitis en cara, 2 episodios de neumonía con derrame. Se interconsulta con nuestro servicio y se le realiza estudio inmunológico: Dosajes de IgG, IgA, IgM, subclases de IgG, C4, funcionalidad de Anticuerpos: normales; C3 disminuido, CH50 ligeramente disminuido, AH50 ausente (en más de 1 determinación). Se estudiaron los factores involucrados en la vía alterna: Factor I y Factor B muy disminuidos, Properdina y Factor H normales. Se lo asume como deficiente de Factor I, con deficiencia secundaria de Factor B. Por la herencia de la enfermedad se estudio a la familia. C3 Factor I Factor B Factor H Properdina AH50 CH50 Paciente 40 5 < 38 580 19 A 160 A:ausente Comentarios: 1.-El hermano presenta resultados de laboratorio comparables con los del paciente. Sin síntomas clínicos. 2.- En la madre se observan valores compatibles con heterocigosis, lo que no se constata en el padre. 314. Un nuevo método para detectar la infección con el virus
de la hepatitis murina (MHV). Patricia A. Mathieu(1), Karina A.
Gómez(1), Jean-Paul Coutelier(2), Lilia A. Retegui(1). El MHV es uno de los virus con mayor prevalencia en ratones de laboratorio, por lo cual se han elaborado varios kits comerciales para detectarlo; estos ensayos se basan principalmente en la presencia, en el suero de los animales infectados, de anticuerpos (Ab) dirigidos contra las proteínas virales. En un trabajo previo demostramos que en los ratones infectados con MHV existen autoAb que reconocen la fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH) de hígado y riñón. Esta observación nos permitió desarrollar un nuevo método que consiste en medir, por medio de un enzimoinmunoensayo (ELISA), la reactividad de los Ab anti-FAH generados por la infección con MHV; hallamos que la FAH de hígado de rata, simplemente purificada por precipitación con etanol y sulfato de amonio, puede ser utilizada como antígeno. Los resultados del ELISA mostraron valores de densidad óptica significativamente mayores para los sueros de ratones infectados con el MHV con respecto a los controles, mientras que no se observó reactividad con muestras provenientes de ratones infectados con el virus elevador de la lactato deshidrogensa, el virus del tumor mamario o el virus de la leucemia murina. Por otro lado, se logró inmunizar ratones con la FAH de rata y así obtener sueros que constituyen los controles positivos internos del ensayo. Este método no requiere el manipuleo del virus, puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio medianamente equipado y es muy económico comparado con los existentes en el mercado. 315. Identificación de regiones antigénicas del factor
estimulante de colonias de granulocitos mediante la síntesis de
péptidos en fase sólida. Verónica J. Marino(1), Aída
Sterin-Prync(2), Leonor P. Roguin(1). El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es una citoquina que estimula la proliferación y diferenciación de precursores neutrófilos. En un trabajo previo, caracterizamos dos anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-G-CSF y demostramos que el mAb 6E3 reconoce un epitope conformacional, mientras que el mAb 8C2 está dirigido principalmente contra un epitope secuencial. Con el propósito de estudiar la interacción del G-CSF con receptores de células de origen mieloide, investigamos el efecto de los mAbs sobre las propiedades biológicas y de unión de la citoquina. Sólo el mAb 6E3 inhibió la proliferación de células inducida por G-CSF y la unión del mismo a sus receptores. Por otro lado, el mAb 8C2 mostró un comportamiento no neutralizante y reconoció una zona expuesta en el complejo G-CSF:receptor. Para identificar los epitopes reconocidos por los mAbs, utilizamos un método de mapeo basado en la síntesis de 84 octapéptidos superpuestos que representan la secuencia completa del G-CSF. La reactividad de los mAbs con cada uno de los péptidos obtenidos se analizó por enzimoinmunoensayo. Aunque esta metodología no permitió detectar el epitope 6E3, identificamos 3 regiones reconocidas por el mAb 8C2. Dos de estas regiones definen un epitope conformacional constituido por las secuencias 39-52 y 155-164 del G-CSF. La tercer región (amino ácidos 115-124) representa un péptido homólogo al epitope 8C2 que no sería reconocida por el Ab en la estructura nativa del G-CSF. 316. Moléculas proinflamatorias que estarían involucradas en
la red de eventos mediados por CD44. Paula V. Cabrera(1), Guillermo
Blanco(1), Sofía H. Greczanik(1), Marina V. Cápula(1), Glenda
Ernst(1), Elida Alvarez(1), Silvia E. Hajos(1). La unión CD44-ácido hialurónico nativo (AHn) participa en la locomoción leucocitaria y la unión a AH de bajo peso molecular (AHb) induce la síntesis de mediadores inflamatorios in vitro. En un modelo murino de inflamación inducida por zymosan evaluamos los eventos inflamatorios que estarían involucrados en los procesos mediados por CD44. Los leucocitos del exudado fueron evaluados a las 4, 12, 24, 48 y 72 h luego del estímulo. Se detectó un aumento del ARNm de CD44 (RT-PCR) con respecto a los controles (ratones inyectados con PBS) y de CD44 de superficie (FACS) a todos los tiempos. Los leucocitos se adhirieron a placas incubadas con AHn (índice de adhesión (IA) a las 4 h 0.66 ± 0.02, 72 h 0.68 ± 0.03) o AHb (4 h 0.66 ± 0.03, 72 h 0.67 ± 0.03) y migraron hacia AH en cámaras de quimiotaxis (índice de migración (IM): AHn 4 h 6 ± 0.08, 72 h 5.7 ± 0.1; AHb 4 h 5.8 ± 0.3, 72 h 5.6 ± 0.2). Ambos efectos fueron inhibidos por anti-CD44 (4h y 72 h: IA AHn 0.31 ± 0.03, 0.39 ± 0.01; AHb 0.28 ± 0.01, 0.38 ± 0.02; MSI AHn 1.89 ± 0.2, 1.79 ± 0.1; AHb 4 h 2.1 ± 0.09, 72 h 2.08 ± 0.3, respectivamente). Se halló un aumento del ARNm de iNOS y de actividad de metaloproteasas (zymografía) con un máximo al principio del proceso, y niveles elevados de ARNm de IL-1 y TNF-alfa. La unión de CD44 a ambas formas de AH participaría en la locomoción de leucocitos. Los resultados muestran la evolución de mediadores de inflamación a lo largo del proceso en forma paralela con la expresión de CD44. 317. Mímica molecular de la interacción proteína-DNA por
anticuerpos anti-idiotípicos. Laura M. Zarebski(1), Ma. Laura
Cerutti(1), Fernando A. Goldbaum(1). A partir de dos anticuerpos monoclonales (MAbs ED10 y ED84) anti-DNA, de alta afinidad y secuencia-específicos contra un oligo de 18 pb de bases del genoma de HPV (Site35), estudiamos fenómenos de mímica molecular en el reconocimiento específico proteína-DNA. Los anticuerpos anti-idiotípicos son una herramienta poderosa para la construcción de un modelo de mímica molecular. Hemos inmunizado conejos con ambos MAbs anti-DNA y hemos obtenido antisueros de alto título (1/24000). Hemos purificado los anticuerpos anti-idiotipicos policlonales e inmunizado ratones, obteniendo una respuesta anti-Site35 significativa aunque de bajo título. Por hibridización de esplenocitos de dichos animales con células de mieloma hemos obtenido 3 hibridomas que reconocen específicamente a los Abs policlonales anti-idiotípicos. Estamos clonando estos hibridomas para evaluar el reconocimiento anti-DNA. En conclusión, hemos demostrado que es posible obtener una respuesta anti-DNA por inmunización xenogeneica con los miembros de la red idiotipo-antiidiotipo a partir de anticuerpos que exhiben especificidad de secuencia. El estudio molecular y estructural de los distintos miembros de esta red nos permitira analizar las bases moleculares de la mímica funcional obtenida. 318. Detección de CD31 intracelular en linfocitos T. Viviana P.
Lutzky(1), Romina P. Carnevale(1), Marcos Barboza(1), María C.
Salamone(1), Leonardo Fainboim(1), Eduardo H. Chuluyan(1). CD31/PECAM-1 es una molécula de 130 KDa perteneciente a la superfamilia de las Inmunoglobulinas. Se halla presente en plaquetas, leucocitos y células endoteliales. Además de poseer un rol en la migración de leucocitos, la molécula interviene en la activación celular. En trabajos previos, demostramos la existencia de CD31 intracelular y un mecanismo de exo-endocitosis en ciertas líneas tumorales. El objetivo del presente trabajo fue detectar reservorios intracelulares de CD31 en linfocitos T (LT). En primer lugar confirmamos que un 35% de los LT expresan CD31 en la membrana (CD31m). Sin embargo, las marcaciones intracitoplasmáticas de la población total de LT demostraron la existencia de una única población de LT CD31+. La presencia de CD31 intracelular se confirmó separando (por ‘sorting´) las poblaciones CD3+ CD31m- y CD3+ CD31m+ (95% de pureza) y realizando posteriormente un ‘Western Blot´ para CD31 sobre la población CD31m-. Además, la caracterización de la población CD31m- arrojó el siguiente resultado: CD4+ = 60%, CD8+ = 21%; CD45RA+ = 58%, CD45RO+ = 52%. En tanto que la población CD31m+ es: CD4+ = 32%, CD8+ = 46%; CD45RA+ = 87%, CD45RO+ = 15%.Estos resultados demuestran que los LT CD31m- presentan reservorios intracelulares de la molécula. 319. La hiperosmolaridad como factor modulador de células
dendríticas. Carolina C. Jancic(1), Leonardo Fainboim(1), Eduardo H.
Chuluyan(1). El aumento de la osmolaridad extracelular modifica la expresión de moléculas de adhesión e inhibe la fagocitosis en ciertas poblaciones leucocitarias. El objetivo del presente trabajo fue evaluar las características fenotípicas y funcionales de las células dendríticas (CDs) en respuesta al aumento de la osmolaridad extracelular. Se utilizaron CDs derivadas de monocitos diferenciados en presencia de IL-4 y GM-CSF. En primer lugar, se examinó la capacidad de un medio hiperosmolar (460-580 mOsm, 30-150 min., 37°C) de inducir la desadhesión de las CDs previamente adheridas a proteínas de matriz extracelular. Entre un 11 ± 1 y un 27 ± 1% (n=3) de las células se despegaron de la matriz en presencia de un medio hiperosmolar de 460 y 580 mOsm, respectivamente. Estos medios también disminuyeron la capacidad de captación de dextrán-FITC (30 ± 1%, n=2) y la expresión de moléculas MHC (35 ± 12%, n=3). Además, estas células mostraron una menor capacidad de estimular la proliferación de linfocitos T alogénicos, comparada con las CDs presentes en un medio iso-osmolar (4700 ± 2300 vs. 9400 ± 4000, n=4, p<0.05). Ninguno de estos efectos fue debido a la inducción de apoptosis o necrosis (medido mediante la marcación con anexina V-FITC y por fragmentación de ADN).Estos resultados sugieren que el aumento de la osmolaridad disminuye la capacidad de las CDs de endocitar antígenos y de estimular la proliferación de linfocitos T alogénicos. 320. Los inhibidores de serino-proteasas aumentan la capacidad
inmunoestimuladora de las células dendríticas. Paulo C. Maffia(1),
Sandra I. Zittermann(1), Maria L. Scimone(1), Leonardo Fainboim(1),
Eduardo H. Chuluyan(1). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la acción de los inhibidores de serino proteasas sobre la fisiología de las células dendríticas (CDs). Se utilizaron CDs humanas generadas a partir de monocitos en presencia de IL-4 y GM-CSF. Estas células fueron incubadas con inhibidores de serino proteasas (aprotinina y leupeptina, 45 min., 37°C). Posteriormente, las células fueron lavadas y examinadas en su capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T alogénicos. Las CDs tratadas con aprotinina (10 mg/ml) fueron mejores estimuladoras de la respuesta alogénica comparadas con las CDs control (6939 ± 1176 vs 10148 ± 1745, p<0.01, n = 17). También se observó un aumento al tratar a las CDs con leupeptina (32 ± 10% de incremento, n = 12). Este efecto no se debió a cambios en la expresión de moléculas co-estimulatorias (CD80 y CD86) o accesorias. Sin embargo, las CDs pretratadas con aprotinina, pero no las controles, producen y liberan IL-12 (5.3 ± 1.8 pg/ml, n = 4). El efecto de la aprotinina y la leupeptina sobre la capacidad inmunoproliferativa y la producción de IL-12 fue específico para las CDs inmaduras ya que no se observó en las CDs maduras o en los monocitos. Estos resultados sugieren que los posibles inhibidores de serino proteasas fisiológicos estarían modulando la capacidad inmunogénica de las CDs inmaduras aumentando la producción de IL-12. 321. Ensayos de linfoproliferación antígeno-específica como
herramienta diagnóstica en alergias a proteínas de leche de vaca.
Rubén D. Motrich(1), Claudio M. Gottero(1), Carlos C.(h)
Rezzonico(2), Carlos C. Rezzonico(2), Virginia E. Rivero(1). Las alergias alimentarias se clasifican en inmediatas (AAI), mediadas por IgE y no inmediatas (AANI), mediadas por células. En este trabajo evaluamos si la metodología de proliferación celular frente a alergenos alimentarios es de utilidad en el diagnóstico de AANI a proteínas de leche de vaca. Realizamos experimentos de proliferación de linfocitos de sangre periférica frente a antígenos de leche de vaca (a-lactalbúmina; b-lactoglobulina; caseína) en 15 niños clínicamente clasificados como alérgicos a leche de vaca y en 6 niños normales. Se clasificó a los pacientes de acuerdo al tiempo transcurrido desde el último contacto con la leche de vaca y se observó que el 86% de los pacientes con contacto reciente (<4 meses) mostraron índices de proliferación (IP) positivos para el ensayo. Sólo un 25% de los pacientes con contacto lejano (>4 meses) presentaron IP positivos. Ningún niño del grupo control presentó IP positivos. En los niveles de IgA e IgG específicas para b-lactoglobulina, encontramos que el 40% y el 20% de los pacientes mostraron niveles más elevados que los normales. En IgA e IgG específicas para a-lactalbúmina, observamos que un 20% de los pacientes,en ambos casos, mostraron niveles superiores a los normales. La marcada diferencia observadas en el ensayo de linfoproliferación antígeno-específica entre la población alérgica y la población normal nos permiten concluir que estos ensayos son una herramienta muy útil en el diagnóstico de laboratorio de las AANI. 322. Bases moleculares de la respuesta inmunosupresora inducida
por Galectina-1: implicancias en el modelo de melanoma B16 murino.
Natalia Rubinstein(1), Rosanna E. Ramhorst(1), Mariano Alvarez(2),
Marta A. Toscano(1), Norberto W. Zwirner(1), Osvaldo L. Podhajcer(2),
José Mordoh(2), Leonardo Fainboim(1), Gabriel A. Rabinovich(1). Recientemente demostramos que galectina-1 (Gal-1) es uno de los principales factores inmunosupresores producidos por células de melanoma humano. En el presente trabajo nos propusimos: a) analizar las subpoblaciones linfocitarias sensibles a la apoptosis mediada por Gal-1, b) investigar las vías involucradas en la acción anti-inflamatoria de esta proteína, y c) estudiar la expresión y actividad inmunosupresora de Gal-1 en el contexto de melanoma murino (B16). Observamos una susceptibilidad selectiva a la apoptosis mediada por Gal-1 en linfocitos T (CD4+ y CD8+), utilizando cultivos de células mononucleares de sangre periférica, en presencia de estímulos mitogénicos y alogénicos. Este efecto inmunosupresor fue bloqueado al incorporar IL-2 o ZVD-fmk (inhibidor de caspasas) al medio de cultivo sugiriendo un mecanismo dependiente de caspasas y reversible por IL-2. A los fines de extrapolar nuestros resultados a un modelo experimental murino in vivo, confirmamos la expresión de Gal-1 en melanoma B16 (mGal-1) mediante ensayos de Western blot y RT-PCR. Posteriormente, subclonamos el cDNA de mGal-1 en su orientación antisentido (Lag-1/pcDNA6) y transfectamos con esta construcción células B16. Observamos disminución significativa de los niveles de mGal-1, respecto a la transfección con el vector control (pcDNA6). Las evidencias expuestas permiten generar nuevas herramientas para implementar estrategias de terapia génica antisentido in vivo que permitan modular la respuesta metastásica 323. Efecto del benznidazol (BZL) sobre la expresión de la
sintetasa inducible del óxido nítrico (NOSi) y el factor de necrosis
tumoral alfa (FNT) en el hígado de ratones con endotoxemia
experimental. María F. Pascutti(1), Josianne Sanceau(2), Jeanne
Wietzerbin(2), Oscar Bottasso(1), Silvia S. Revelli(1). Previamente demostramos que el BZL inhibe la expresión de la NOSi en macrófagos estimulados ‘in vitro’ con lipopolisacárido (LPS) y en el hígado de ratones C57BL/6 inoculados con LPS, a las 4 hs post-desafío (pd). Dado que los ratones también tienen menores niveles séricos de FNT a los 90' pd, se investigó si el BZL modulaba la expresión de esta citoquina a nivel hepático (sitio relevante en sepsis). Ratones C57BL/6 (n=10) se inocularon con 200µg de LPS/ratón, vía ip. La mitad de ellos recibió BZL (LPS+BZL), vía oral, 18 y 2 hs antes del desafío con LPS (200 mg/kg peso). Se obtuvieron los hígados a los 90' y 4 hs pd para la extracción del ARN total y posterior RT-PCR. La semi-cuantificación de los mensajeros se realizó luego de una co-amplificación y normalización con un control interno de b-actina. La expresión del ARNm para la NOSi fue evidente a las 4 hs pd, hallándose inhibida en un 72% en los LPS+BZL. La expresión máxima del FNT se observó a los 90' pd y el análisis densitométrico reveló una disminución del 24% en los LPS+BZL. Los niveles séricos de FNT fueron inferiores en el grupo LPS+BZL a los 90' pd, no mostrando diferencias a los 15 y 30' pd (media ± es pg/ml: 15', LPS 6.3 ± 4.8, LPS+BZL 16.5 ± 7.0; 30', LPS 479.6 ± 139.6, LPS+BZL 470.7 ± 133.6). Si bien la regulación negativa del BZL en la producción del FNT podría encontrarse a nivel de la síntesis de novo de la proteína, en el hígado el mecanismo no estaría operando principalmente a nivel transcripcional.
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