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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES EN POSTER PROLIFERACION Y MUERTE CELULAR II 197. Caracterización de la actividad del coactivador TIF-2
sobre GR y NF-kB. Ignacio M. Nojek(1), Lorena Franco(1), Luciana
Tonelli(1), Mónica A. Costas(1). En trabajos anteriores propusimos un mecanismo de antagonismo entre citoquinas y glucocorticoides por competencia en la unión a coactivadores de GR y NF-kB. Demostramos que los coactivadores de la familia p160 del GR también son coactivadores de NF-kB, promoviendo la actividad transcripcional de ambos factores, en forma dosis coactivador dependiente. Con el objeto de determinar si TIF-2, un coactivador de GR y NF-kB, constituye una molécula por la cual compitan ambos factores, o bien podría formar parte de un complejo capaz de aumentar la transactivación por ambos factores, se analizó 1) dominios de TIF-2 involucrados, transfectando células HeLa con vectores conteniendo deleciones del coactivador y 2) si además de la actividad histona acetil transferasa previamente descripta para estos coactivadrores existía alguna otra actividad enzimática asociada. Se observó 1) que determinados dominios del coactivador aumentan la actividad transcripcional de uno y no la del otro factor, 2) que TIF-2 recluta actividad quinasa, ya que inmunoprecipitados con anticuerpos específicos para TIF-2 presentan un patrón específico de bandas cuando es incubado con ATP marcado radioactivamente. Esto sugiere que de existir competencia entre GR y NF-kB por la unión a TIF-2, los dominios requeridos son diferentes y no se descarta la formación de complejos conteniendo: TIF-2/GR/NF-kB. Los complejos llevando TIF-2 reclutan actividad quinasa, posiblemente involucrada en la regulación de la transcripción. 198. Alteraciones metabólicas producidas por arsénico en
macrófagos alveolares in vitro. Mónica Palmieri(1), Deborah
Tasat(2), Beatriz Molinari(3). El arsenito de sodio (As) disminuye la incidencia tumoral en modelos de cáncer experimental en ratones, relacionado probablemente con la disminución del metabolismo oxidativo en células inflamatorias. En este trabajo analizamos in vitro aspectos del metabolismo celular asociado a procesos redox en macrófagos alveolares (MA) tratados con (As). En cultivos de MA se evaluaron: la viabilidad celular, la actividad específica de la formazana ( densidad óptica por célula/area), el porcentaje de células con endosomas reactivos y el de células con cristales de formazana. A) %viabilidad celular actividad específica control 90 2,2 2,8 3,5 3,8 *Estadisticamente significativos con respecto al control
(p>0,05) 199. Los niveles relativos de proteinas Bcl-X son afectados por
la actividad de MAPKs. Luciana Rocha Viegas(1), Alfonso J. Soler
Bistué(1), Lino S. Barañao(2), Miguel Beato(3), Omar A. Coso(4),
Adalí Pecci(1). Las MAPKs se asociaron con procesos como proliferación, diferenciación o muerte celular. Se tiende a ligar la activación de Erk1/2 con la supervivencia celular y altos niveles de JNK o p38 (SAPKs) con apoptosis. Asi, un balance entre las actividades de Erk1/2 y SAPKs influirían el destino celular. Los productos del gen bcl-X son intermediarios en la transducción de señales que regula la apoptosis. Las dos isoformas que genera tienen funciones opuestas: Bcl-XL (antiapoptótico) y Bcl-XC (proapoptótico). Se demostró una correlación entre la abundancia relativa de estas proteínas y la apoptosis en células RENTROP (epitelio uterino de rata). El objetivo fue analizar el efecto de EGF en el control de la expresión de las dos isoformas de bcl-X. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa realizados con ARNm obtenidos de células incubadas con EGF mostraron una reversión en la relación Bcl-XL/Bcl-XC (EGF=0.8; Control=15.8). Este efecto se inhibió con el bloqueante PD90589 y por dexametasona y progesterona (inhibidores de la apoptosis en RENTROP). Ensayos del gen reportero luciferasa bajo el control del promotor de bcl-X mostraron que la actividad del promotor P2 se inhibió con EGF (Trat./Ctrol = 6±0.1). Estos resultados se confirmaron por RT-PCR realizadas con primers específicos. Nuestros resultados sugieren que EGF podría controlar la apoptosis a través de la regulación de la expresión de bcl-X mediante un mecanismo en el cual participarían MAPKs en un escenario de complejidad creciente. 200. Regulación de la expresión de Bax durante la apoptosis
inducida por dexametasona en timocitos de ratón. Esteban Hoijman(1),
Luciana Rocha Viegas(1), Ruth E. Rosenstein(2), Adalí Pecci(1). La involución del timo mediada por glucocorticoides fue uno de los primeros eventos asociados al proceso de apoptosis. Los miembros de la familia Bcl-2 fueron propuestos como componentes relevantes, regulatorios de la muerte y supervivencia celular y como factores ‘blanco’ de diversos estímulos apoptóticos. El objetivo de este trabajo fue analizar el patrón de expresión de estas proteínas en respuesta al tratamiento con dexametasona en cultivos primarios de timocitos de ratón. Mediante ensayos de western blot se determinaron los niveles de Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-XC y Bax. Los resultados indican que la dexametasona, luego de 2 h. de incubación, aumentó los niveles de Bax respecto al control (Dex/Control = 2.1± 0.3), en tanto que los niveles de las demás proteínas no se modificaron. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa demostraron que la dexametasona aumentó los niveles del ARNm de bax luego de una hora de incubación (Dex/Control =1.7± 0.4). Se ha descripto que el factor de transcripción p53 regula la expresión de algunos miembros de la familia Bcl-2; por lo tanto se analizaron los niveles de esta proteína. Los resultados demuestran que la expresión de p53 no varía en presencia de la hormona. En suma, estos resultados permiten postular a la proteína Bax como un intermediario de la inducción de apoptosis dependiente de glucocorticoides. Su expresión podría estar inducida por la hormona a través de un mecanismo independiente de la inducción de p53. 201. Mecanismos mitocondriales involucrados en la apoptosis
inducida por el virus de la estomatitis vesicular. Ximena Perfetti(1),
Felix C. Coulombié(1), Patricia Gadaleta(1). El virus de la estomatitis vesicular (VSV) induce apoptosis en distintas células de mamíferos. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado la intervención del sistema de caspasas, como así también la presencia y modulación de diversas proteínas pro- y anti-apoptóticas durante la apoptosis inducida por dicha infección viral en cultivos de células Vero. En este trabajo se investigaron los eventos mitocondriales asociados a dicho proceso. Estudios preliminares nos han indicado que la apoptosis que se observa en las células Vero durante la infección con el virus VSV se desencadena tempranamente dentro del ciclo viral. Para abordar el estudio a nivel mitocondrial hemos analizado los cambios en el potencial de membrana mitocondrial mediante un fluorocromo específico (MitoCapture, Alexis Biochem.) el cual mediante fluorescencia permite discriminar dichos cambios, los cuales fueron detectados a partir de 1 hora postinfección. Además, empleando anticuerpos monoclonales anti-citocromo C (Cit. C) y anti- AIF (Factor inductor de apoptosis), hemos observado que tanto el Cit. C como el AIF se liberan de la mitocondria y translocan al citosol (Cit. C ) y al núcleo (AIF), tempranamente a partir de la primera hora postinfección. Estos experimentos nos permiten concluir que la mitocondria juega un papel central en el proceso apoptótico que sufre la célula infectada por VSV. 202. Efecto de la prostaglandina E2 (PGE2) sobre la actividad
celular adenohipofisaria. Papel del óxido nítrico (NO). Jimena P.
Cabilla(1), Ariel H. Benitez(1), Cristian C.A. Bodo(1), Miguel O.
Velardez(1), Beatriz H. Duvilanski(1). La PGs, así como también el NO, intervienen en un número de procesos biológicos involucrados en la proliferación celular, diferenciación y apoptosis. Previamente demostramos que el NO estimula la actividad de COX en la adenohipófisis. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la PGE2 sobre la proliferación celular en cultivos provenientes de ratas hembras, y la posible participación del NO en dicho efecto. Como índice de viabilidad se midió la actividad deshidrogenasa mitocondrial (AC, método de MTT). Las células fueron incubadas durante 24 y 48 hs con concentraciones crecientes de PGE2. La PGE2 ,en concentraciones de 10-7 M y mayores, disminuyó la AC (absorbancia a 600 nm) (Control: 0.350 ± 0.009, PGE2 10-8 M: 0.333 ± 0.011, PGE2 10-7 M: 0.304 ± 0.011*,PGE2 10-6 M: 0.175 ± 0.005***, PGE2 10-5 M:0.033 ± 0.002***, n=8, p<*0.01, ***0.001 vs Control). La hemoglobina (Hb, 10-5M), un secuestrador de NO, no modificó la AC (Control: 0.350 ± 0.013, 0.323 ± 0.006, n=8), sin embargo revirtió parcialmente el efecto de la PGE2 (AC): PGE2 10-8 M: 0.343 ± 0.007, Hb+PGE2 10-8 M: 0.320 ± 0.004, PGE2 10-7 M: 0.313 ± 0.007*, Hb+PGE2 10-7 M: 0.340 ± 0.008^, PGE2 10-6 M: 0.145 ± 0.005***, Hb+PGE2 10-6 M: 0.268 ± 0.008^^, n=8, *p<0.01, ***p<0.001 vs Control, ^p<0.01,^^p<0.001 vs las respectivas PGE2. Estos resultados demuestran por primera vez un efecto citotóxico de la PGE2 sobre las células adenohipofisarias y sugieren una participación del NO en dicho efecto. 203. Papel protector del óxido nítrico (NO) en el efecto
citotóxico del cadmio sobre las células adenohipofisarias. Ariel H.
Benitez(1), Cristian C.A. Bodo(1), Jimena P. Cabilla(1), Miguel O.
Velardez(1), Beatriz H. Duvilanski(1). El Cadmio (Cd2+), in vivo e invitro, afecta al sistema endócrino. Sin embargo, poco se conoce sobre su mecanismo de acción a nivel adenohipofisario. El propósito de este trabajo fue evaluar el efecto del Cd2+ sobre la viabilidad celular en cultivos de células adenohipofisarias de ratas machos. Como índice de viabilidad se midió la actividad deshidrogenasa mitocondrial (AC, método de MTT). Las células fueron incubadas durante 48 hs con concentraciones crecientes de CdCl2. El Cd2+ disminuyó la AC (Absorbancia 600 nm) a concentraciones iguales o mayores de 10 microM. (Control: 0.239 ± 0.020; Cd2+ 1 microM: 0.252 ± 0.009; Cd2+ 10 microM: 0.175 ± 0.011**; Cd2+ 25 microM: 0.096 ± 0.005** p<0.01 vs control). DETA NONOato (DETA/NO, 0.1 mM), un dador de NO, revirtió el efecto del Cd2+ (Control: 0.231 ± 0.007; Cd2+ 25 microM: 0.083 ± 0.010***; DETA/NO 0.1 mM: 0.289 ± 0.014^^^; Cd2+ + DETA/NO: 0.128 ± 0.006***, ^^. *** p<0.001 vs respectivo control sin Cd, ^^ p<0.01 ^^^ p<0.001 vs respectivo control sin DETA/NO). L-NAME, inhibidor de la NO sintasa, y Hb, un secuestrador de NO, potenciaron la disminución de la actividad celular inducida por el Cd2+. Estos resultados muestran un efecto citotóxico del Cd2+ sobre las células adenohipofisarias y sugieren que el NO ejercería un papel citoprotector atenuando el efecto del Cd2+. 204. Quimiorresistencia a doxorrubicina dependiente de la
confluencia en una línea celular mamaria murina normal. Mariana
Beviacqua(1), Marcela A. Sandoval(2), Juan C. Calvo(3). La línea NMuMG (glándula mamaria murina normal) demostró una capacidad de migración incrementada comparada con células tumorales, y viabilidad luego de la exposición a doxorrubicina (dox,Gador) por 96 hs o a un suplemento de SFB del 3%. Basados en estas observaciones, evaluamos el efecto del tratamiento por 48 horas con dox, sobre la proliferación y el metabolismo celular de NMuMG, las líneas murinas LM3 (carcinoma mamario) y 3T3-L1 (preadipocitos normales).Controles:células sin tratamiento. La quimiosensibilidad fue evaluada por incorporación de 3H-timidina (3H-t) y ensayo MTT (bromuro de tetrazolio).El metabolismo celular no fue significativamente afectado (ns) por dox (MTT=CI50 para 3T3-L1:500 ± 3,6 ng/ml; NMuMG:250 ± 10,3 ng/ml; LM3:CI50 no alcanzada,dosis 2000 ng/ml). Contrariamente, el efecto fue marcado en la proliferación (3H-t= CI50 para LM3:30 ± 3,6 ng/ml; 3T3-L1:50 ± 6,3 ng/ml; ns-ANOVA-Tukey). NMuMG mostró dos respuestas: toxicidad a bajas dosis y resistencia a altas. Esta diferencia se correlacionó con el grado de confluencia de las células:CI50 para NMuMG subconfluentes: 100 ± 5 ng/ml, postconfluentes: 730 ± 7 ng/ml (p<0,001 entre sí y comparada con LM3 y 3T3-L1).Fenómenos dependientes de confluencia alterarían la respuesta de las células NMuMG a la dox, confiriéndoles ventajas de sobrevida y resistencia a su acción antiproliferativa. 205. Nivel de Oxido Nítrico (NO) inducido por Lipopolisacárido
(LPS) y regeneración hepática. Teresa Ronco(1), María de Luján
Alvarez(1), María C. Carrillo(1), Juan A. Monti(1), Cristina
Lugano(2), Gerardo Pisani(2), Cristina E. Carnovale(1). En estudios previos demostramos que la inhibición de NOS2 no produce el aumento de NO a las 5 horas post-hepatectomía, existiendo disminución de LPO y del índice de regeneración. Objetivo: Analizar la influencia del aumento de NO producido por inducción de NOS2 con LPS en el proceso de regeneración. Métodos: Ratas Wistar machos adultas fueron divididas en 3 grupos (n=5): Control, LPS 2 mg / kg PC i.p. (LPS1) y LPS 4 mg / kg PC i.p.(LPS2). Cada grupo se subdividió en 2: Sham (Sh) y hepatectomizadas 65% (Hp). Las ratas fueron sacrificadas a las 5 y 24 horas luego de la cirugía. Resultados: El nivel de la enzima NOS2, mostró un aumento del 24% en los grupos Hp tratados respecto de la Hp Control. Se observó un aumento significativo de NO medido como contenido de nitratos citosólico (nmol de nitrato/mg de proteína): Hp-Control 5h: 8,90±1,2; Hp-LPS1 5h: 16,1±1,9* Hp-LPS2 5h: 12,3±0,7* (*p<0,05). El nivel de lipoperoxidación se determinó como nmoles de malondialdehído/100mg proteína microsomal (Hp-Control 5h: 112±7; Hp-LPS1 5h: 144±6*; HP-LPS2 5h: 139±5*). El índice de regeneración estimado como incorporación de [3H]-timidina al ADN (dpm/mg ADN) en las ratas pretratadas con LPS1 y LPS2 no mostró modificaciones en el pico observado normalmente a las 24h después de una HP (HP-24h-C: 41250±3100). Conclusión: La inducción de NOS2 por LPS es independiente de las dosis estudiadas. El aumento temprano de NO y LPO no producen modificaciones en el proceso de regeneración hepática. 206. Modulación de la proliferación de hepatocitos porcinos
cultivados in vitro sin matrices exógenas. Mariana R. Barbich(1),
Alicia S. Lorenti(1), Vanina Morales(1), Gabriela Barrientos(1),
Silvia Racedo(1), Alejandra Hidalgo(1), Florencia Callero(1), Pablo
Argibay(1). Células provenientes de hígados porcinos podrían ser utilizadas como el componente biológico de un hígado bioartificial. Para ello es necesario estudiar los parámetros que permitan obtener el mayor número de células viables y funcionales. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad proliferativa de hepatocitos porcinos adultos cultivados en ausencia de matrices exógenas, en medios con diferente composición de factores de crecimiento y suero fetal bovino (SFB). Las células fueron cultivadas durante 30 días. El pico proliferativo, determinado a través de la incorporación de *H timidina, se observó en todos los casos el día 10, obteniéndose el valor máximo (8653.94 +/- 2048cpm) al usar 1% de SFB y medio completo (insulina, EGF, BPE, hidrocortisona y transferrina). En iguales condiciones, pero en presencia de 10% de SFB el valor cayó a 2484.07 +/- 1396.06 cpm. En ausencia de hidrocortisona la capacidad proliferativa se mantuvo por un período mayor (20 días). En ausencia de insulina o EGF, las células sólo permanecen pegadas al sustrato de cultivo durante 15 días, independientemente del agregado de los otros factores de crecimiento. Podemos concluir que la composición de factores de crecimiento tiene un efecto modulador sobre la capacidad proliferativa y la adherencia de las células a largo plazo. Particularmente, la presencia de SFB tiene efecto inhibitorio sobre la capacidad proliferativa de los hepatocitos porcinos. 207. Oxido nítrico mitocondrial, estado redox y desarrollo
hepático. Daniela Converso(1), Sabrina Skverer(1), Damián
Levismán(1), María C. Carreras(1), Juan J. Poderoso(1). El óxido nítrico (NO) producido por la NO sintasa mitocondrial (mtNOS) regula el consumo y la producción de especies activas del oxígeno. Considerando que estas especies participan en la regulación del ciclo celular, el objetivo propuesto fue comparar la actividad de mtNOS (3H-L-citrulina), de Mn-SOD (espec-trofotometría) y la velocidad de producción del peróxido de hidrógeno (H2O2, fluorometría) de mitocondrias aisladas de hígado de ratas adultas (A) y recién nacidas (P2-4). Los resultados demuestran que la actividad de mtNOS está disminuida en las ratas neonatas respecto de las adultas (A: 29±2 vs P2-4: 19±2 pmoles/min.mg prot., p<0.05), al igual que la producción máxima de H2O2 estimulada por antimicina (A: 0.13±0.02 vs P2-4: 0.11±0.02 nmoles/min.mg prot., n.s.). La producción de H2O2 dependiente de NO (en presencia de L-Arg 100 µM vs L-Arg + 1mM L-NMMA), fue mayor en las adultas (A: 0.10±0.01 vs P2-4: 0.06±0.01 nmoles/min.mg.prot, p<0.05), con un cociente H2O2 (NO-dependiente): H2O2 (máxima) de A: 0.77 vs P2-4: 0.55, en concordancia con las respectivas actividades de mtNOS. La actividad de MnSOD también se encontró disminuída en las ratas neonatas (A: 1.42±0.11 vs P2-4: 0.83±0.12 nmoles/mg.prot, p<0.05). Los datos sugieren que en esta etapa del desarrollo hepático, las actividades de mtNOS y MnSOD controlan la concentración citosólica de H2O2, contribuyendo a la regulación redox-dependiente del ciclo celular.
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