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EFECTOS DE LA INSULINA SOBRE LA RESPUESTA CONTRACTIL Y LA
CAPTACION DE CALCIO EN AORTA DE RATA
ALEJANDRO REBOLLEDO,
VERONICA MILESI, GUSTAVO RINALDI, ANGELA GRASSI
Cátedras de Anatomía y
Fisiología y de Fisiología Humana, Departamento de
Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad
Nacional de La Plata
Key words: aorta, insulina, angiotensina II, noradrenalina,
retículo sarcoplásmico,
captación de Ca2+
Resumen
La
insulina afecta mecanismos fisiológicos generales que regulan la
presión arterial, y a nivel celular modifica las funciones del
endotelio y del músculo liso vascular, que son determinantes de la
resistencia periférica. Describimos los efectos de la preincubación
con insulina (40 µU/ml, durante 1-2 hs) sobre la reactividad
contráctil de anillos
intactos de aorta de rata y sobre la captación de 45Ca2+ en segmentos
de aorta de rata
hiperpermeabilizados por tratamiento con EGTA. La preincubación con
insulina no afectó las contracciones inducids por 1 µM de NA, ni la
relajación de lasmismas inducida or 10 mM de cafeína. La respuesta
contráctil a 1 µM de Ang-II (que en la aorta de rata es
independiente de endotelio) fue estimulada por la preincubación con
insulina en la fuerza máxima desarrollada y en la velocidad de
relajación espontánea de la contracción. La diferencia en la
captación de 45Ca2+ en RS entre los segmentos de aorta tratados y no
tratados con insulina fue mayor a los 5 minutos con respecto a la
medida a los 30 minutos. Se concluye que la preincubación con
insulina afecta en forma directa la respuesta mecánica del músculo
liso aórtico estimulado con Ang-II y se propone a la modificación de
la actividad del RS como uno de los mecanismos mediante el cual la
insulina participa en la regulación del ca2+ citosólico.
Abstract
Effect
of insulin on contractile response and calcium ceptation in rat aorta.
Insulin affects physiological mechanisms involved in blood
pressure regulation, and
at the cellular level modifies endothelial and vascular smooth muscle
functions underlying the changes in peripheral resistance. We describe
the effects of preincubation with inslin (40 µU/ml for 1-2 hs) on the
contractile reactivity of intact rat aortic rings and on 45Ca2+ uptake
of EGTA-hyperpermeabilized rat aortic segments. Preincubation with
insulin did not affect either contractions induced by 1 µM of NA, or
their relaxation induced by 10 mM of caffeine. the contractile
response to 1 µM of Ang-II (which in rat aorta is
endothelium-independent) was stimulated by insulin preincubation
resulting in increases of both maximal developed force and velocity of
its spontaneous relaxation. The difference in 45Ca2+ uptake between
insulin-treated and insulin-untreated aortic segments was greater at 5
minutes than it was at 30 minutes.
Conclusions: Insulin preincubation affects directly the mechanical
response of Ang-II
stimulated aortic smooth muscle; we suggest that the modification of
SR function is one of the mechanisms involved in insulin regulation of
cytosolic Ca2+.
Dirección postal: Dra. Angela O. Grassi, c.c. 219, Correo
Central, 1900 La Plata, Argentina
Recibido: 19-III-1996 Aceptado: 16-VIII-1996
La asociación de hiperinsulinemia y/o resistencia insulínica con
hipertensión arterial ha
originado numerosos estudios sobre la participación de la insulina en
la regulación del tono vascular. La insulina afecta mecanismos que
disminuyen directa o indirectamente la
concentración de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i). En sarcolema estimula
la actividad de la Na+-K+- ATPasa1-3, y el mayor gradiente
extra/intracelular de Na+ y la hiperpolarización resultantes de este
efecto, pueden respectivamente activar el intercambio Na+/Ca2+ e
inhibir el influjo de Ca2+ por canales voltaje operados (VOC). Otro
efecto es el de aumentar la expresión de la Ca2+-ATPasa del retículo
sarcoplásmico4 lo cual mejoraría la capacidad de este depósito para
acumular Ca2+. La modificación de estos mecanismos por la insulina
tendrían como correlato mecánico la relajación del músculo liso
vascular. Estudios 'in vivo' apoyan esta hipótesis ya que la insulina
produce vasodilatación del lecho vascular del antebrazo que depende
sólo parcialmente de la liberación de óxido nítrico por el
endotelio5. Los resultados
con preparaciones 'in vitro' también muestran que los aumentos
transitorios de [Ca2+]i
inducidos por agonistas presores son atenuados por la preincubación
de las células de
músculo liso vascular con insulina. Este efecto sobre los niveles de
Ca2+ intracelular se ha
demostrado para angiotensina II (Ang II), noradrenalina (NA) y
argininavasopresina (AVP) en arteria mesentérica de rata6, para
serotonina en arteria femoral canina7 y para AVP en aorta de rata y
arteria pulmonar humana8. En este último estudio también se
demostró que la preincubación con insulina estimulaba la velocidad
de recuperación de la [Ca2+]i a niveles de reposo en contracciones
inducidas por Ang II y por AVP. La aceleración de la remoción del
calcio citosólico siguiendo a la estimulación se relacionó con la
capacidad de la insulina para aumentar la expresión del ARNm de las
Ca2+-ATPasas de membrana y de retículo sarcoplásmico4.
Las atenuaciones de los aumentos transitorios del calcio intracelular
producidas por la
insulina, cuyo correlato mecánico debe ser una menor contracción
vascular, son
independientes del endotelio ya que se han descripto en células de
músculo liso vascular
aisladas y/o en cultivo. En la rata se ha encontrado que la
relajación vascular inducida por la insulina tampoco depende del
endotelio9. Se ha descripto que la insulina aumenta la síntesis y
secreción de endotelina en células endoteliales y el número de
receptores a endotelina en músculo liso vascular10. De manera que la
respuesta mecánica de anillos de aorta expuestos a insulina puede
estar condicionada tanto por sus efectos relajantes actuando sobre el
músculo liso vascular como por sus efectos contrayentes actuando
sobre el endotelio y sobre el músculo liso vascular. Es posible
postular que la exposición de los vasos a la insulina incremente la
actividad de mecanismos relacionados con la relajación vascular y que
la falta de este estímulo debido al estado de resistencia insulínica
sea una de las causas para que se produzca la asociación entre
resistencia insulínica e hipertensión arterial.
El objetivo de este trabajo fue determinar si la preincubación con
insulina facilita el
mecanismo de relajación en anillos de aorta intactos contraídos por
agonistas fisiológicos, y si este efecto se correlaciona con la
activación del transporte de Ca2+ en depósitos
intracelulares. Se estudió si la preincubación con insulina
afectaba:
1. la respuesta mecánica de anillos de aorta con endotelio intacto
estimulados con Ang II y NA en ausencia de insulina.
2. la captación de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico de segmentos
de aorta hiperpermeabilizados por tratamiento químico.
Métodos
Determinaciones mecánicas
Se utilizaron ratas machos de la cepa Wistar, de 250-300 g de peso
a las que se les
extrajo la aorta bajo anestesia con eter etílico. Luego de separar el
tejido conectivo se
cortaron de la porción torácica de la aorta anillos de alrededor de
2 mm; los anillos fueron conectados en forma isométrica a un
transductor de fuerza (Letica TRI 201) y sumergidos en una cámara
plástica conteniendo solución de Krebs-Ringer-bicarbonato (KRB)
equilibrada con 5% de CO2 y 95% de O2 y termostatizada a 37° C. La
solución cotenía en mM: ClNa 130, ClK 4,7, CO3HNa 24, PO4HNa2 1, 17,
SO4Mg 1, 16, Cl2Ca 1,6 y glucosa 11. La señal del transductor fue
ingresada a una plaqueta adquisidora y conversora analógico/digital
(Data Traslation inc. modelo DT-01-EZ) a una frecuencia de 27 Hz y
almacenada en computadora para obtener valores y registros gráficos
de fuerza desarrollada en función del tiempo. Se impuso una tensión
de reposo de 3 g que se ajustó durante el período de estabilización
de 1 hora con cambios de la solución cada 20 minutos. Se realizaron 4
protocolos experimentales:
1. Grupo control para la estimulación con Ang-II:
a. contracción por adición de 1 µM de Ang-II. (Contracción
transitoria con relajación
espontánea)
b. lavado de la Ang-II
c. incubación durante una hora con KRB control
d. segunda contracción por adición de 1 µM de Ang-II
2. Grupo incubado con insulina para la estimulación con Ang-II:
Se siguió la misma secuencia que en el protocolo 3) y durante la hora
de incubación (paso c) se le agregó al KRB 40 µU/ml de insulina de
tipo corriente y origen bovino. El paso d. se realizó en ausencia de
insulina.
3. Grupo control para la estimulación con NA:
a. contracción por adición de 1 µM de NA
b. adición de 10 mM de cafeína para provocar una relajación rápida
similar a la obtenida con Ang-II.
c. incubación durante 1 hora con KRB control
d. segunda contracción por adición de 1 µM de NA
e. adición de 10 mM de cafeína para provocar relajación
4. Grupo incubado con insulina para la estimulación con NA:
Se siguió la misma secuencia que en el protocolo 1) y durante la hora
de incubación (paso c) se le agregó al KRB 40 µU/ml de insulina de
tipo corriente y origen bovino. Los pasos d. y e. se realizaron en
ausencia de insulina.
Los parámetros medidos en los registros fueron: fuerza máxima
desarrollada en gramos (F), tiempo necesario para que se relaje la
mitad de F en seg (t½), y velocidad media de relajación hasta la
mitad de F en g/seg (V). Los resultados se presentan como valores
medidos en la estimulación previa y en la posterior a la incubación.
La comparación se realizó entre promedios de diferencias de los
parámetros medidos en las dos estimulaciones (pre y post incubación)
para los grupos no tratados y tratados con insulina.
Determinaciones de captación de 45Ca2+ en segmentos de aorta
tratados con EGTA
La aorta fue obtenida como se describió previamente y cortada en
segmentos cuyo
peso promedio fue de 12,1 ± 0,25 mg (n = 208). Luego de colgar los
segmentos en alambres de acero inoxidable (0,2 mm), se agruparon por
pares (2 por cada aorta) y se incubaron durnate dos horas a 37° C;M
de cada par, uno de los segmentos se incubó en KRB control y el otro
en KRB con 40 µU/ml de insulina. Terminada la incubación se
sumergieron durante 24 hs a 4° C en una solución conteniendo en mM:
EGTA 5, propionato de K5, Hepes (pH 7) 20, ditiotreitol 1, Cl2Mg 0,4 y
sacarosa 150. Este tratamiento permeabiliza la membrana plasmática y
permite que las organelas intracelulares estén en contacto con las
soluciones de captación conteniendo 45Ca2+ y con las soluciones de
lavado11. Luego del 'pelado' químico los segmentos fueron usados para
medir captación de 45Ca2+ en retículo sarcoplásmico (RS) en
función del tiempo. Pares de segmentos incubados previamente uno sin
y otro con insulina, se sumergieron en una solución mantenida a 20°
C conteniendo en mM: EGTA 0,71, 45Ca-EGTA 0,29 (0,5 µM de calcio
libre12), propionato de K 100, Hepes (pH 7) 20, ditiotreitol 1, Cl2Mg
5,76 (1 mM libre12), ATPNa2 0',57 (0,5 µM libre12) y sacarosa 150.
Los tiempos de
captación fueron de 2, 5, 10 y 30 minutos, al cabo de los cuales los
segmentos fueron
lavados durante 15 minutos en una solución mantenida a 4-6° C
conteniendo en mM: EGTA 1, propionato de K 100, Hepes (pH 7) 20, Cl2Mg
1, ATPNa2 5 y rojo de rutenio 0,05. Luego se sumergió cada segmento
en 1 ml de EDTA 1 mM (pH 7) durante 1 hora. Se midió la
radioactividad remanente en el tejido en econtador de centelleo
líquido. La captación de calcio se expresa en nmoles por mg de
tejido húmedo.
Se compararon diferencias de captación en cada par de segmentos de
aorta incubados
previamente uno sin y otro con insulina.
Los resultados se muestran como promedios ± 1 error estandar. Se usó
el test de "t" de
Student para muestras apareadas aceptándose un valor de p < 0,05
para la significación
estadística. Las drogas usadas fueron de grado analítico; Ang-II,
cafeína y NA se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St Louis,
Missouri, la insulina se obtuvo de Laboratorios Beta.
Resultados
Registros típicos de contracciones inducidas por 1 µM de NA antes
y después de la
incubación sin insulina o con insulina se muestran en la Figura 1. La
tabla I muestra los
valores para los parámetros determinados en los grupos estimulados
con NA, control y
preincubado con insulina. La incubación no cambió la fuerza máxima
inducida por NA en el grupo control ni en el tratado con insulina. La
incubación tiende a disminuir el t½ y a aumentar la velocidad de
relajación tanto en el grupo control como en el incubado con isulina
alcanzando significación estadística sólo para el t½ en el grupo
incubado con insulina. Las diferencias entre pre y post incubación no
fueron significativas entre el grupo control y el tratado con insulina
(Figura 2).
Los resultados obtenidos con dos estimulaciones sucesivas de Ang-II
separadas por un
período de incubación sin y con insulina se muestran en la Figura 3
y en la tabla II. Cuando se estimuló dos veces consecutivas con
Ang-II, separadas por una hora de incubación, se produjo en el grupo
control una caída en F de la segunda contracción con respecto a la
primera como manifestación de la taquifilaxia a la droga (Fig. 3,
panel superior). En el grupo incubado con insulina no hubo cambios de
F en la segunda contracción con respecto a la primera (Fig. 3, panel
inferior). El efecto más notable de la insulina sobre las
contracciones inducidas por Ang-II fue sobre la velocidad de
relajación que aumentó 0,43 ± 0,16 g/seg en la segunda contracción
con respecto a la primera, mientras que en el grupo control disminuyó
en 0,63 ± 0,18 g/seg (P < 0,005 comparando diferencias entre
control e incubado con insulina). El t½ no cambió significativamente
por la incubación con insulina con respecto al grupo control (Figura
4).
La Figura 5 muestra los resultados obtenidos en la captación de
45Ca2+ medida en
segmentos de aorta hiperpermeabilizados; la captación en los
segmentos preincubados con insulina durante 2 horas no fue
significativamente diferente de la medida en los segmentos
preincubados por igual tiempo sin insulina. Las diferencias en la
captación entre pares de segmentos se muestran en el panel inferior;
en los segmentos incubados con insulina la captación a los 5 minutos
tiende a ser más elevada pero es deprimida a tiempos mayores. La
insulina produce diferencias en la captación con significación
estadística si se comparan los tiempos de 5 y 30 minutos.
Discusión
La preincubación con insulina de segmentos de aorta de rata produce
un aumento en la
fuerza desarrollada y en la velocidad de relajación de las
contracciones inducidas por Ang-II. Según hallazgos previos8, estos
resultados podrían explicarse porque la elevación transitoria del
Ca2+ intracelular inducida por Ang-II está modificada por la
preincubación con insulina durante un tiempo similar al usado en el
presente estudio en dos aspectos: aumento del pico de calcio y aumento
de la velocidad de recuperación de los niveles de calcio a su valor
de reposo. El efecto de aumentar la contracción podría explicarse
por el hecho de que la preincubación con insulina libera endotelina
de las células endoteliales y/o aumenta el número de receptores a
endotelina en las células de músculo liso aórtico10, potenciando el
efecto de la Ang-II que también libera endotelina13. Sin embargo, en
aorta de rata la desendotelización no modifica la respuesta a la
Ang-II como lo hace en la arteria de la cola, donde toda la
contracción es dependiente de la liberación de endotelina13.
Nuestros resultdaos no coinciden aparentemente con los que reportan
una atenuación producida por insulina sobre las contracciones
inducidas por la Ang-II7. La razón de la discrepancia puede residir
en que en dichos estudios la contracción fue medida como acortamiento
de las fibras musculares lisas antes y 10 minutos después de
estimularlas con el agonista, y en nuestros registros la contracción
alcanza su valor máximo dentro de los 5 minutos de iniciada la
estimulación y se relaja en forma inmediata; de manera que las
mediciones de acortamiento caerían en la fase de relajación que es
la acelerada por la insulina. Nuestros resultados mecánicos orientan
a sostener que el efecto de la insulina de potenciar las contracciones
por Ang-II depende en forma directa de las modificaciones que ella
produce sobre los mecanismos que regulan la [Ca2+]i en los miocitos
aórticos. El aumento de la expresión de la bomba de calcio del
retículo sarcoplásmico4 puede explicar aumentos simultáneos en la
fuerza pico y en la velocidad de relajación. Una mayor densidad de la
bomba en las membranas reticulares puede permitir un mayor nivel de
calcio acumulado en estado estacionario para ser liberado por
estímulos que movilizan el Ca2+ de depósitos intracelulares (aumento
de la fuerza pico) y también incrementar la velocidad de la retoma de
calcio (aumento de la velocidad de relajación). Nuestros resultados
sobre captación de Ca2+ en segmentos de aorta hiperpermeabilizados
muestran que la preincubación con insulina tiende a aumentar el
calcio acumulado a tiempos cortos (5 minutos) y a deprimirlo cuando la
captación tiende a ser máxima (30 minutos). Una posible explicación
de estos insulina afecte no sólo a la actividad de la ca2+-ATPasa
sino también al eflujo de Ca2+ del RS que durante el
período de captación no está inhibido. La demostración de que el
eflujo de Ca2+ en el RS aumenta por la preincubación con insulina
permitiría sostener esta hipótesis. No podemos descartar que los
efectos de la preincubación con insulina manifestados como
alteración de la respuesta mecánica a Ang-II no sean diferentes
luego del tratamiento con EGTA ni que las condiciones del medio de
captación (temperatura, buffer) distintas a las del ensayo mecánico
puedan modificar dichos efectos.
En forma similar a la estimulación con Ang-II y 5-HT la NA evoca
aumentos de la [Ca2+]i que son atenuados por la preincubación con
insulina en la arteria mesentérica de rata14. Sin embargo nuestros
resultados en segmentos de aorta de rata intactos muestran que la
preincubación con insulina no afecta la respuesta mecánica a NA. Hay
evidencias de que la insulina no afecta la reactividad a NA en aorta
de ratas insulinopénicas (ratas diabéticas por tratamiento con
estreptozotocina)15-17. Por otra parte, en aortas de ratas diabéticas
espontáneas y por administración de estreptozotocina se ha detectado
un aumento de la respuesta rápida a NA (dependiente de la liberación
de Ca2+ de depósitos intracelulares), que se corrige después del
tratamiento con insulina18. En nuestros experimentos la velocidad de
relajación inducida por la cafeína sobre la contracción por NA fue
modificada por la preincubación con insulina con respecto al control,
posiblemente porque los mecanismos puestos en juego por la cafeína
para relajar estén activados en forma máxima con 10 mM de cafeína
y/o no sean afectados por la preincubación con insulina.
La asociación entre resistencia insulínica y/o hiperinsulinemia e
hipertensión arterial está
avalada por estudios epidemiológicos9, 18. Para explicar esta
asociación se proponen efectos de la insulina que son primariamente
extravasculares, como la estimulación del sistema nervioso simpático
y la retención renal de sodio, y efectos directos de la insulina
sobre los vasos5, 9. Sin embargo estos últimos son complejos e
incluyen modificaciones de procesos celulares que tanto ueden aumentar
como disminuir el tono vascular, de manera que el nexo que relaciona
los efectos vasculares de la insulina con la hipertensión arterial
puede establecerse por dos vías diferentes: la resistencia
insulínica suprime los efectos vasodilatadores de la insulina o los
efectos vasoconstrictores de la insulina se manifiestan en mayor grado
que los vasodilatadores ante una hiperinsulinemia. El presente trabjao
demuestra que preincubar con insulina segmentos de aorta de ratas
intactos condiciona al vaso para que se contraiga más y por menos
tiempo al ser estimulado por Ang-II, una respuesta que puede estar
relacionada con la modificación de la actividad del RS mediante la
cual participa en la regulación del calcio citosólico. Si se
demuestra que estos resultados son similares en vasos humanos, los
niveles de insulina fisiológicos cumplirían un rol de modificar en
forma directa mecanismos celulares que dan base a la respuesta
mecánica del músculo liso vascular.
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Fig. 1.-- Registros típicos de contracciones inducidas por
noradrenalina 1 µM que
se relajan por el agregado de cafeína 10 mM. Panel superior:
experimento control: primera contracción (-) y segunda contracción
post-incubación con KRB sin insulina (- - -) Panel inferior:
experimento con insulina: primera contracción (-) y segunda
contracción post- incubación con KRB con 40 µU/ml de insulina (-
-).
Fig. 2.-- Efectos de la preincubación con insulina sobre las
diferencias medidas (delta = post- incubación - preincubación) en
las contracciones inducidas por noradrenalina 1 µM. F = fuerza
máxima desarrollada, t½ = tiempo necesario para que se relaje la
mitad de F, v = velocidad media de relajación hasta la mitad de F.
Fig. 3.-- Registros típicos de contracciones inducidas por
angiotensina II 1 µM. Panel
superior: experimento control: primera contracción (-) y segunda
contracción post-incubación con KRB sin insulina (- -). Panel
inferior: experimento con insulina: primera contracción (-) y segunda
contracción post-incubación con KRB con 40 µU/ml de insulina (- -)
Fig. 4.-- Efectos de la preincubación co ninsulina sobre la
sidferencias medidas (delta = post- incubación - preincubación) en
las contracciones inducidas por angiotensina II 1 µM. F = fuerza
máxima desarrollada, t½ = tiempo necesario para que se relaje la
mitad de F, v = velocidad media de relajación hasta la mitd de F.
Fig. 5.-- Panel superior: curva de captación de Ca2+ en segmentos
de aorta de rata
preincubados (-l-) y no preincubados (-o-) con 40 µU/ml de insulina.
Panel inferior: diferencias de captación de Ca2+ en pares de
segmentos de aorta de rata preincubados y o preincubados con 40 µU/ml
de insulina (delta = preincubado - no preincubado con insulina). *
indica diferencia significativa entre los valores de 5 y 30 minutos.
TABLA I.-- Valores de fuerza máxima desarrollada (F), tiempo
necesario para relajar
la mitad de F (t½) y velocidad media de relajación hasta la mitad de
F (V) de las contracciones inducidas por NA 1 µM
F (g) t½ (seg) V (g/seg)
Na control (n = 6)
preincubación 1,02 ± 0,08 80 ± 3 6,47 ± 0,65
postincubación sin insulina 1,02 ± ,09 65 ± 13 8,51 ± 1,04
Na-insulina (n = 10)
preincubación 1,06 ± 0,07 80 ± 8 7,11 ± 0,72
postincubación con insulina 1,01 ± 0,08 57 ± 4* 9,15 ± 0,81
TABLA II.-- Valores de fuerza máxima desarrollada (F), tiempo
necesario para relajar
la mitad de F (t½) y velocidad media de relajación hasta la mitad de
F (V) de las contracciones inducidas por Ang-II 1 µM.
F (g) t½ (seg) V (g/seg)
Ang-II-control (n = 5)
preincubación 0,48 ± 0,04 164 ± 56 1,66 ± 0,32
postincubación sin insulina ,18 ± 0,01* 101 ± 28 1,04 ± 0,16
Ang-II-insulina (n = 5)
preincubación 0,40 ± 0,04 144 ± 28 1,62 ± 0,29
postincubación con insulina 0,34 ± 0,03 95 ± 18 2,05 ± 0,39
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