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EVALUACION DE LA PRODUCCION DE CITOQUINAS EN ENFERMOS
DE LEPRA
SUSANA FINK1, MARTA R.
FINIASZ1, RAUL VALDEZ2, SILVIA DE LA
BARRERA, MARIA DEL CARMEN SASIAIN1
1 Departamento
Inmunología, Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia
Nacional de Medicina; 2 Hospital Gral. San Martín, Buenos Aires
Key words: lepra, CMP, IL-2, IL-4, IFN-g, IL-6
Resumen
El
objetivo de este estudio fue evaluar la producción de citoquinas por
células mononucleares periféricas (CMP) obtenidas de pacientes con
lepra, cuando esta células son estimuladas con ConA, PPD o
Mycobacteriumleprae. Medimos IL-2, IL-4, IFN-g e IL-6 en sobrenadantes
libres de células, por enzimoinmuno-ensayos. Nuestros resultados no
sugieren una clara asociación entre una forma clínica de lepra y un
perfil de secreción de citoquinas de tipo Th1 o Th2 en las CMP de los
pacientes con lepra.
Abstract
Evaluation
of cytokine production in leprosy patients. The aim of the present
study was to evaluate the cytokine production by paripheral blood
mononuclear cells (PBMC) of leprosy patients when the cells were
stimulated in culture by ConA, PPD or M.leprae. We measured IL-2,
IL-4, IFN-g and IL-6 in cell-free supernatants by enzyme linked
immunoassays. Our results do not suggest a clear association of a
clinical form of leprosy with a Th1 or Th2 cytokine secretion profile
in PBMC of leprosy patients.
Dirección postal: Dra. Susana Fink, Instituto de
Investigaciones Hematológicas,
Academia Nacional de Medicina, Pacheco de Melo 3081, 1425, Buenos
Aires
Los antígenos estimulan en el huésped una respuesta inmune
predominantemente celular o humoral, tipo Th1 o Th2 respectivamente1,
que puede ser adecuada para proteger contra un agente infeccioso
dado2. La lepra es la enfermedad causada por el Mycobacterium leprae,
patógeno intracelular obligado, y abarca un amplio espectro de formas
clínicas. En un polo, lepra tuberculoide, aparece una fuerte
reacción de hipersensibilidad retardada,
característica de las respuestas Th1, útil para eliminar
micobacterias. En el otro extremo del espectro clínico, lepra
lepromatosa, hay multiplicación de bacilos por la débil respuesta
celular, generalmente asociada a un perifl de tipo Th2. Las citoquinas
pueden modular la respuesta inmune, en particular la generación de
linfocitos T citotóxicos. Anteriormente, trabajando con células
mononucleares periféricas (CMP) de pacientes con lepra, estudiamos la
actividad citotóxica específica contra macrófagos autólogos
gatillados con Mycobacterium leprae, y describimos diferencias en las
distintas formas de la enfermedad3. Se observaba un incremento con
IL-6, IFN-g o la combinación de IL-2 con IL-6, y una disminución con
IL-44. Para determinar si este comportamiento de las CMP reflejaba un
patrón de secreción de citoquinas particular, evaluamos con
enzimoinmunoensayos la presencia de IL-2, IL-4, IFN-g, IL-6 en
sobrenadantes de CMP cultivadas en presencia de M. leprae.
Se estudiaron 9 pacientes lepromatosos (LL), 3 borderline lepromatosos
(BL), 1 borderline (BB), 7 tuberculoides (TT) y 3 borderline
tuberculoides (BT), clasificados según Ridley y Jopling5. Se
subdividieron en 2 grupos: paucibacilares (PB: TT y BT) (5 mujeres, 5
hombres, 26-71 años) y multibacilares (MB: LL, BL, BB)(5 mujeres, 8
hombres, 18-76 años). También se estudiaron 4 pacientes LL con
eritema nudoso leproso (ENL)(varones, 19-55 años) tratados con
talidomida. Todos los pacientes estaban libres de otras enfermedades
infecciosas y recibían el tratamiento mutlidroga recomendado por la
Organización Mundial de la Salud. Se estudiaron simultáneamente 5
controles normales vacunados con BCG (N)(2 mujeres, 3 hombres, 30-52
años). Se
purificaron CMP por centrifugación de sangre heparinizada sobre un
gradiente de Ficoll-Hypaque6. Se resuspendieron en medio de cultivo
1640 conteniendo 15% de suero fetal bovino inactivado por calor (ambos
de Gibco Lab, NY, USA) y antibiótico (medio completo). Se estimularon
2 x 106 células/ml con M. leprae irradiado (1,8 x 107 bacilos/ml,
generosamente provistos por el Dr. Rees, Mill Hill, UK, a través del
banco IMMYC de la OMS), o PPD (10 ug/ml, Statens Seruminstitut,
Dinamarca), antígeno relacionado, o ConA (20ug/ml, SIGMA, MO, USA),
durante 48 h o 5 a 7 días, a 37°C en atmósfera humidificada con 5%
CO2, en tubos Falcon 2063. Los sobrenadantes libres de células fueron
divididos en alícuotas y conservados a -70°C hasta ser ensayados
para IL-2, IL-4 e IFN-g. Los monocitos se purificaron por adherencia a
plástico durante 2 horas a 37°C.
Después de 6 días, se estimularon los macrófagos con antígenos
durante 18 h y se recogieron los sobrenadantes para determinar IL-6.
Todas las determinaciones de citoquinas se hicieron empleando equipos
de ELISA comerciales (Genzyme, Boston, USA) y se ensayaron duplicados
de cada muestra. El límite de detección es: 100 pg/ml para IL-2, 45
pg/ml para IL-4, 100 pg/ml para IFN-g y 18 pg/ml para IL-6, según las
indicaciones del fabricante. "0*" significa por debajo del
límite de detección, ND: no determinado. Los sobrenadantes de
cultivo de CMP de 48 h presentaron niveles no
detectables de IL-2, IL-4 e IFN-g cuando se estimuló con PPD y M.
leprae, tanto
en los pacientes PB como en los MB, excepto en un paciente TT y un
paciente LL cuyas células produjeron IFN-g al ser estimuladas con M.
leprae (Tabla 1).
Cuando se estimuló con ConA, se observó producción de IL-2, pero no
de IL-4 y de IFN-g, salvo en un paciente LL en el que se detectó
IFN-g y en otro LL en el que se encontró IL-4 en la muestra sin
estímulo. La cantidad de IL-2 producida por los pacientes MB en
respuesta a la ConA era mayor que la generada por los PB en la
mayoría de los casos (Tabla 1). Las CMP de 2 pacientes LL evaluados
durante ENL mostraron secreción de IFN-g. La que tenía mayor
concentración de IFN-g también contenía IL-2 y la otra contenía
IL-4 (Tabla 1). No observamos diferencias en la producción de IL-6
por células control y estimuladas (Tabla 2). En un paciente TT y en 2
LL hubo un aumento con PPD, mientras que en un BT la screción fue
mayor en los macrófagos control que en los estimulados con M. leprae.
En 2 de los pacientes MB estudiados había menor producción de Il-6,
y en 2 LL mayor, en respuesta a la PPD. Cuando se utilizó M. leprae
se detectó más IL-6 en 2 pacientes LL, y menos en un BL. Sólo en
uno de los 4 LL que estudiamos durante ENL, los macrófagos produjeron
más IL-6 por estimulación. También se evaluaron muestras obtenidas
a 5 y 7 días en 5 pacientes (2 LL, 2 TT, 1 BT) (datos no mostrados).
La producción de IL-2 en el paciente BT aumentó de 1213 pg/ml en el
día 2 a 3293 pg/ml en el día 5 con ConA. Se
detectó IFN-g sólo en los sobrenadantes de un paciente TT (100 pg/ml
con ConA, 1100 pg/ml con PPD, por debajo del límite de detección con
M. leprae) a los 5 días. La IL-4 estaba presente en sobrenadantes
celulares de un paciente LL a las 48 h (150 pg/ml) con ConA y a los 5
días con los otros estímulos (C: 190 pg/ml, ConA: ND, PPD: 80 pg/ml,
M.lep.: 280 pg/ml). En el paciente BT todos los estímulos indujeron
secreción de IL-4 al día 5 (75 pg/ml en C, 93 pg/ml con ConA, 920
pg/ml con M.lep.), mientras que en el paciente TT ya mencionado la
producción de IL-4 observada al día 5 (180 pg/ml en la muestra
control) aumentaba a 310 pg/ml en las células estimuladas tanto con
ConA como con M. leprae, siendo mayor la producción de Il-4 con M.
leprae.
Varios autores asociaron perfiles definidos de secreción de
citoquinas con una
forma clínica de lepra estudiando los linfocitos recuperados de las
lesiones. Yamamura y col7,8 correlacionaron un perfil Th1 con la forma
resistente de la enfermedad y uno Th2 con la lepra lepromatosa, usando
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa
(RT-PCR) del ARNm que codifica para varias citoquinas. También fue
analizada la secreción de estos mediadores biológicos por clones
derivados de CMP de estos pacientes9. Estableciendo líneas celulares
T a partir de CMP, Mutis y col10 estudiaron el perfil de secreción de
citoquinas de linfocitos T reactivos para el M. leprae. Encontraron
que las micobacterias inducen preferentemente respuestas de tipo Th1
(altos títulos de
IFN-g y TNF-a) en todo el espectro de la lepra, aunque algunos de los
clones T podían producir al mismo tiempo IL-4 e IFN-g (Th0). En un
estudio de Launois y col11, todos los antígenos del M. leprae
probados inducían secreción de IL-6 en cultivos de CMP de pacientes
con lepra, a diferencia de los de controles normales. En la
tuberculosis humana hay una respuesta Th1 disminuída al Mycobacterium
tuberculosis que es restaurada por el tratamiento terapéutico,
haciendo que el estudio de los pacientes en distintos momentos de
evolución pueda dar resultados contradictorios12. Algo similar
podría ocurrir en la infección por M. leprae.
Recientemente, Misra y col13 publicaron el perfil de secreción de
citoquinas de CMP obtenidas de pacientes con lepra, determinado por
RT-PCR y confirmado por ELISA. En este estudio, 40-50% de todos los
individuos presentan un perfil mixto, tipo Th0 con presencia
simultánea de IL-4 e IFN-g, independientemente del estímulo empleado
y de la clasificación clínica de los pacientes. En 5 de los 8
pacientes LL observaron un perfil tipo Th2 y en 3/5 tuberculoides uno
Th1. Nuestros resultados no sugieren una asociación clara entre la
forma clínica de la lepra y un patrón de secreción de citoquinas de
tipo Th1 o Th2 en las CMP de los pacientes con lepra. Parecería haber
un retardo en la respuesta a ConA en el grupo PB, mientras que los
niveles más elevados observados en los pacientes
MB podrían reflejar la activación in vivo, o deberse a la prsencia
en las CMP demás células capaces de responder a la estimulación con
ConA. No hemos encontrado un patrón Th0 como el observado por Misra y
cols13. Sólo en un paciente LL-ENL detectamos secreción simultánea
de IL-4 e IFN-g con ConA, así como en un paciente TT evaluado al día
5. En el paciente BT estudiado al día 5, detectamos IL-4 e IL-2, pero
no IFN-g, el marcador habitual para células Th1, al estimular con M.
leprae. En otro paciente TT, se observó producción de IFN-g en
respuesta a M. leprae al día 2, mientras que en el otro caso LL-ENL
se obtuvo IL-2 e IFN-g con ConA. Esto correspondería al perfil Th1
que Misra encontró en 3 de 5 pacientes TT. Por otro lado, en un
paciente LL se observó producción de IL-4, típico de un perfil Th2,
pero sólo en la muestra control, tal vez por activación in vivo de
las células.
Nuestros resultados difieren de los obtenidos con linfocitos
recuperados de las lesiones, tal vez por haber en éstas una
retención preferencial de algunas células, dejando una población
diferente en circulación periférica. Por otro lado, sería
importante analizar el ARN mensajero para citoquinas y la presencia
intracelular de citoquinas para completar el estudio.
Agradecimientos: Este trabajo se realizó con subsidios del
CONICET y del componente Inmunología de la Lepra (IMMYC) del Programa
Especial para Investigación y Entrenamiento en Enfermedades
Tropicales (TDR) de UNDP/World Bank/OMS. Los autores agradecen a la
Dra. María Marta Bracco por su estímulo y la lectura crítica del
manuscrito.
Bibliografía
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uninfluenced by related antigens of Mycobacterium leprae. Immunol
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TABLA 1.-- Producción de IL-2, IL-4 e IFN-g por CMP de pacientes
con
lepra
a) IL-2 (pg/ml)
Pacientes C ConA PPD M.lep
3-TT 0* 0* 0* 0*
5-TT 0* ND 0* 0*
PB 6-TT ND 1213 ND ND
8-BT 0* 3566 ND 0*
10-BT 0* 1716 ND 0*
11-BT 0* 1644 0* 0*
4-LL 0* 3330 ND 0*
7-LL 0* 3244 ND 0*
MB 8-LL 0* 3467 0* 0*
9-LL 0* 1966 ND 0*
10-BL 0* 3426 181 0*
12-BL 0* 347 0* 0*
ENL 1-LL-ENL 0* 0* 0* 0*
2-LL-ENL 0* 670 ND 0*
C 2-N 0* 1985 120 0*
b) Il-4 (pg/ml)
Pacientes C ConA PPD M.lep
1-TT 0* ND 0* 0*
5-TT 0* ND 0* 0*
PB 8-BT 0* 0* ND 0*
10-BT 0* 0* ND 0*
11-BT 0* 0* 0* 0*
1-LL 0* ND 0* 0*
4-LL 0* 0* ND 0*
MB 8-LL 0* 0* 0* 0*
9-LL 150 0* ND 0*
ll-BL ND ND ND 0*
ENL 1-LL-ENL ND 195 0* 0*
2-LL-ENL 0* 0* ND 0*
C 1-N 0* 210 0* ND
c) IFN-g(pg/ml)
Pacientes C ConA PPD M.lep
1-TT 0* ND 0* 360
PB 5-TT 0* ND 0* 0*
8-BT 0* 0* 0* 0*
11-BT 0* 0* 0* 0*
1-LL 0* ND 0* 360
4-LL 0* 0* ND 0*
MB 7-LL ND 180 ND ND
8-LL 0* 0* 0* 0*
9-LL 0* ND ND 0*
ENL 1-LL-ENL ND 440 0* 0*
2-LL-ENL 0* 2800 0* 0*
1-N 0* 1750 0* ND
C 4-N 0* ND 0* 0*
5-N ND 880 ND ND
TABLA 2.-- Producción de IL-6 por macrófagos de pacientes con
lepra
IL-6 (pg/ml)
Pacientes C PPD M.lep
PB
2-TT 0* ND 0*
3-TT 0* 561 0*
4-TT 1883 1792 1775
5-TT 625 ND 819
8-BT 395 ND 312
9-BT 2490 2790 2395
10-BT 403 ND 0*
MB
2-LL 531 1047 490
3-LL 0* 60 0*
4-LL 1193 0* 1006
5-LL 856 2286 847
6-LL 511 ND 837
7-LL 711 224 1156
8-LL 704 202 601
9-LL 0* ND 796
10-BL 0* 0* 0*
11-BL 377 369 229
12-BL 596 594 265
13-BB 0* 0* 0*
ENL
1-LL-ENL 63 134 0*
2-LL-ENL 110 31 116
3-LL-ENL 1458 ND 1200
4-LL-ENL 281 590 423
N
2-N 60 ND 503
3-N 471 ND 681
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