EL PERFIL NEUROENDOCRINO ESPECIFICO ES CRITICO PARA UNA CORRECTA RESPUESTA INMUNE T-DEPENDIENTE*

CAROLINA PEREZ CASTRO, MARCELO PAEZ PEREDA, ELIZABETH A. KELLER, EDUARDO ARZT

Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires

* Trabajo premiado durante la reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, noviembre 1997

Key words: SRBC, TRH antisense, prolactin, T-lymphocytes, immune modulation

Resumen

Existe una relación funcional entre los sistemas neuroendocrino e inmune. Examinamos el rol de los cambios neuroendocrinos, particularmente hormona liberadora de tirotrofina (TRH) y prolactina (PRL), durante el curso de la respuesta inmune T-dependiente. En ratas inmunizadas ip con eritrocitos de carnero (SRBC, antígeno T-dependiente), se observó: a) un incremento del ARNm de TRH hipotalámica entre las 4 y 24 h post-inmunización (ej: SRBC vs salina: 4 h, 2,8x), en contraste a una disminución del ARNm de TRH observado por tratamiento con antígenos T-independientes (ej: LPS vs salina: 4 h, 1,6x); b) un incremento del ARNm del receptor de TRH y de los niveles de PRL plasmática sin observarse cambios, en los niveles plasmáticos de hormona de crecimiento y tirotrofina. La inyección intracerebroventricular (icv) en ratas conscientes y en movimiento de oligonucleótidos antisentido al mRNA de TRH produjo: a) una inhibición en la producción de anticuerpos anti-SRBC [ELISA 7 días: Ig(M+G): TRH sentido vs TRH-antisentido: 384 ± 27 vs 193 ± 22 (n = 11); p < 0.001, ANOVA con test de Scheffé’s]; b) una incapacidad en producir el pico de liberación de PRL luego de la inmunización (12 h post-inmunización, TRH-sentido vs TRH-antisentido: 8.3 ± 1.4 vs 2.2 ± 0.5 (n = 6), p < 0.01, ANOVA con test de Scheffé’s); c) una disminución del ARNm de TRH hipotalámica (TRH-sentido vs TRH-antisentido: 12 h, 1.7x). Estos estudios demuestran que un antígeno T-dependiente requiere de una activación temprana de TRH y PRL , instrumental para montar una respuesta adecuada, en contraste a la inhibición inducida por antígenos T-independientes.

Abstract

The specific neuroendocrine profile is critically involved in an adequate T-dependent immune response. A functional relationship between the neuroendocrine and immune systems has been clearly established. We examined the role of neuroendocrine changes, particularly thyrotropin-releasing hormone (TRH) and prolactin (PRL), during the T cell-dependent immune response. After immunization of rats with sheep red blood cells (SRBC, a T cell-dependent antigen) we observed: a) an increase of hypothalamic TRH mRNA at 4 to 24 h post-immunization (i.e: SRBC vs saline: 4 h, 2.8x), in contrast to the decrease of TRH mRNA observed following treatment with LPS, a T-independent antigen (LPS vs saline: 4 h, 1.6x); b) an increase in pituitary TRH receptor mRNA and plasma PRL levels but no changes in thyroid-stimulating hormone and growth hormone plasma levels. Intracerebroventricular (icv) injection in conscious freely-moving rats of antisense oligonucleotide complementary to rat TRH mRNA resulted in: a) a significant inhibition of specific antibody production [ELISA 7 days: Ig(M+G): TRH sense vs TRH-antisense: 384 ± 27 (n = 11) vs 193 ± 22 (n = 11); p < 0.001] b) an inability to produce the peak in plasma PRL levels in rats immunized with SRBC [(12h post-immunization, TRH-sense vs TRH-antisense: 8.3 ± 1.4 (n = 6) vs 2.2 ± 0.5 (n = 6); p < 0.01]; c) a decrease in hypothalamic TRH mRNA (TRH-sense vs TRH-antisense: 12h, 1.7x). These studies demonstrate that the T-cell antigen needs an early activation of TRH and PRL for an adequate immune response, in contrast to the inhibition induced by a T-cell independent antigen.

Dirección postal: Dr. Eduardo Arzt, Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, Ciudad Universitaria - Pabellón II, 1428 Buenos Aires, Argentina.  Fax: 54-1-780-2788. E-mail: earzt@b6.fcen.uba.ar

La respuesta inmune se ve acompañada por cambios homeostáticos en el sistema neuroendocrino. Neurotransmisores y hormonas endocrinas son los principales mensajeros por los cuales el cerebro influye sobre los procesos inmunes. A su vez, citoquinas secretadas por células inmunes y otros tipos celulares actúan sobre el sistema nervioso central (SNC), autónomo y neuroendocrino1. La mayoría de los mecanismos involucrados en estas interacciones han sido caracterizadas por administración de endotoxina (LPS), un inmunógeno que causa una respuesta de tipo T-independiente a través de la activación de macrófagos y linfocitos B. Esta respuesta, en contraste a una de tipo T-dependiente (Eritrocitos de Carnero-SRBC), no induce expansión clonal. A diferencia del LPS, que produce una activación temprana del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), el SRBC induce un incremento en la producción de corticosterona plasmática entre el día 5 y 7 de la inmunización, concomitante con el incremento en la producción de anticuerpos2.
Existen numerosas evidencias que indican la importancia de la prolactina (PRL) y de la hormona liberadora de tirotrofina (TRH) durante la respuesta inmune. TRH, un tripéptido, es tanto el mayor factor liberador hipotalámico de TSH como el factor estimulador de PRL mejor conocido. Se ha observado que células humanas mononucleares periféricas expresan el ARNm del receptor de TRH (TRH-R)3. A su vez, un incremento significativo en la síntesis de ADN es observada en esplenocitos estimulados con Concanavalina A (Con A) y fitohema-glutinina (PHA), al añadir TRH al cultivo. Este aumento en la capacidad proliferativa de esplenocitos y timocitos ha sido observada al inyectar TRH en animales de experimentación3. La TRH estimula la producción de interferón-g e interleuquina-2 (IL-2) en linfocitos, y un incremento de los niveles de IL-2 en humanos a los 30 min de haber sido sometidos al test de TRH. La PRL es sintetizada y secretada por células lactotrofas de la pituitaria anterior, donde su secreción es inhibida por catecolaminas, particularmente dopamina. Ejerce un potente rol inmunomodulador4. El receptor de PRL es expresado en todas las c?ulas inmunes y la PRL podr? ser producida por los linfocitos T4. Además, induce la expresión del receptor de IL-2 en estas células. Roedores de experimentación hypofisectomizados exhiben una importante disminución en la capacidad de producir anticuerpos, en la respuesta proliferativa linfocitaria y en la reducción de la actividad de células natural killer (NK). El transplante de pituitarias a ratas hipofisectomizadas restaura la capacidad de producir anticuerpos, luego de ser inyectados los animales con SRBC. Similarmente, la administración in vivo de bromocriptina, un inhibidor de PRL, inhibe la proliferación de células T5.
En el presente trabajo estudiamos los cambios neuroendocrinos que tienen lugar durante la respuesta inmune T-dependiente. Centrándonos en las acciones de PRL y TRH, investigamos si estas hormonas juegan algún rol durante la fase de expansión clonal de células T en respuesta a SRBC. Para ello, ratas Wistar macho (180-200 g) fueron inmunizadas intraperitonealmente (ip) con SRBC (10 x 109 células/ml)6. Tanto el grupo experimental (inmunización con SRBC), como el control (inyectados con solución fisiológica libre de endotoxina), fueron sacrificados a distintos tiempos (2-4-6-24 h y 4-7 d) post-inyección. En cada tiempo, fueron removidos pituitaria, hipotálamo y bazo obteniéndose muestras de sangre troncal. La respuesta T-independiente fue inducida por una inyección con LPS (1 mg/kg).
Con el objeto de validar el modelo de inmunización con SRBC comparamos con reportes previos2 la activación del eje HPA, así como de linfocitos T2. Al día 7 de la inmunización los niveles de corticosterona en plasma (RIA) fueron significativamente elevados en comparación a los niveles de los animales control (Tabla 1), tiempo en el cual ya se ha montado la respuesta primaria a SRBC, evidenciada por un elevado título de anticuerpos anti-SRBC (ELISA)6 (srbc vs. salina: 488 ± 45 vs 206 ± 66, respectivamente, p < 0.01, ANOVA con test de Scheffé’s). Para verificar una correcta estimulación de las células T, medimos los niveles de IL-2 (el principal factor de crecimiento de las células T) en el sobrenadante de esplenocitos proveniente de animales inmunizados y animales control, estimulados con Con A luego de 48 h de cultivo. En tiempos tempranos de la inmunización (6 h post-inmunización: SRBC vs salina: 33.1 ± 3.51 U/ml vs 20.4 ± 2.1 U/ml; p < 0.01, ANOVA con test de Scheffé’s; n = 8), los niveles de la citoquina fueron incrementados, mientras que a los 7 días post-inmunización, fueron similares a los de los animales control.
Habíamos demostrado previamente que los niveles en plasma de PRL se incrementan significativamente en animales inmunizados con SRBC respecto de los animales control en tiempos tempranos de la inmunización (2, 6 y 24 h post-inmunización), mientras que a los 4 y 7 días no se encuentran diferencias significativas. Por el contrario, encontramos que tanto los niveles en plasma de TSH como los de GH, no muestran cambios significativos (Tabla 1).
Para investigar si los niveles del ARNm de TRH hipotal?ica est? alterados luego de una inmunizaci? con SRBC, los medimos mediante la t?nica de Northern blot, evidenci?dose por una ?ica banda de 1.7 kb. Como consecuencia de la inmunizaci? con SRBC encontramos un aumento en los niveles del ARNm de TRH a las 4, 6, 18 y 24 h post-inmunizaci?. Dicho incremento no fue observado a las 2 h o > 24 h post-inmunizaci? (SRBC vs salina: 4 h, 2, 8x), obteni?dose valores similares entre las 4 y 24 h). Es importante remarcar que el efecto que el SRBC produce sobre los niveles del ARNm de TRH es opuesto al evidenciado previamente7 por el tratamiento con LPS (LPS vs salina: 4 h, 1.6x).
La expresión del ARNm el TRH-R fue examinada en los mismos experimentos. Luego de 6 h de inmunización, los niveles del ARNm del TRH-R fueron marcadamente elevados con comparación con los animales control, con una disminución a las 24 h y 4 días de la inmunización, sin evidenciar cambios a los 7 días post-inmunización.
Lo siguiente fue evaluar si el aumento de TRH y PRL tempranos tienen un rol en la respuesta inmune humoral a SRBC. Para ello realizamos un tratamiento inyectando, en forma intracerebroventricular (icv) a ratas conscientes y en movimiento, oligonucleótidos antisentido al mRNA de TRH hipotalámica (GeneBank Data Base M12138; AACCAAGGTCCCGGCATCCTGGAGGATGC, secuencia complementaria a la región de iniciación de la transcripción del mRNA de TRH)8. En los experimentos ilustrados en la figura 1A-B, observamos una inhibición significativa en la producción primaria de anticuerpos anti-SRBC en los animales tratados con el TRH-antisentido [Ig(M+G)]. Por el contrario, en los grupos de animales control (animales tratados icv con oligonucleótido TRH-sentido y vehículo), no se observan modificaciones, siendo similar el título en ambos grupos.
Bajo el conocimiento de que la presencia de inmunoglobulinas del tipo G1 (IgG1) y G2a (IgG2a) denota una respuesta T-helper 2 (Th2) y Th1 respectivamente, decidimos medir ambos subtipos, mediante la técnica de ELISA. Como muestra la figura 1C-D, la producción específica de los distintos subtipos (IgG1 y IgG2) fue severamente suprimida en los animales tratados con el TRH-antisentido. Observamos una inhibición más pronunciada sobre la producción de IgG1 que sobre la de IgG2a. Este resultado podría estar sugiriendo una influencia mayor del tratamiento con el TRH-antisentido sobre la respuesta Th2.
Doce horas post-inmunización, los niveles de expresión del ARNm de TRH hipotalámica fueron marca-damente menores en los animales tratados icv con el TRH-antisentido, respecto de los grupos control (12 h post-inmunización, 1.7x). Además, observamos que bajo este tratamiento se bloquea eficientemente el aumento en los niveles de PRL en plasma inducidos por la inmunización con SRBC, a diferencia de los grupos control, los cuales presentan niveles de la hormona incremen-tados en respuesta al antígeno (12 h post-inmunización, TRH-sentido vs TRH-antisentido): (8.3 ± 1.4 vs 2.2 ± 0.5) mg/ml, n = 6, p < 0.01, ANOVA con test de Scheffé’s]. Se realizó además la confirmación histológica en el sitio de la inyección. Estos resultados demuestran la eficiencia del tratamiento con el oligonucleótido antisentido y la asociación entre la disminución del título de anticuerpos con la TRH y PRL.
En el presente trabajo mostramos por primera vez que los cambios neuroendocrinos que ocurren durante el curso de una respuesta inmune T-dependiente (por ejemplo: modelo SRBC) son fundamentalmente diferentes a los que ocurren en una respuesta inflamatoria de tipo T-independiente (modelo LPS) e instrumentales para el montaje de una adecuada respuesta. Dentro de las primeras 24 horas, la respuesta T-dependiente evoca un aumento en los niveles de expresión del ARNm de TRH así como en los niveles de PRL en plasma. Este aumento temprano es cr?ico para el montaje de una adecuada respuesta, lo cual es demostrado al ser bloqueada por el tratamiento con el TRH-antisentido. Acorde con estos resultaddos, el ant?eno T-dependiente induce la respuesta supresora del eje HPA s?o en una fase tard? de la respuesta, cuando ?ta ya ha sido montada (5-7 d?s), logrando de esta forma suprimir la activaci? de clones inespec?icos; en contraste al temprano pico de corticosterona en plasma inducido por el ant?eno T-independiente. El rol instrumental de la activación temprana del eje TRH-PRL es demostrado por la inhibición en la producción de anticuerpos específicos anti-SRBC como consecuencia del tratamiento con oligonucleótidos antisentido al ARNm de TRH. La respuesta de TRH y PRL como consecuencia de un tratamiento con LPS (un antígeno que no induce expansión clonal de linfocitos T) es opuesta a la evidenciada por un antígeno de tipo T-dependiente. Se ha demostrado que IL-1 (inducida por LPS) inhibe tanto los niveles de PRL en plasma9, como los niveles del ARNm de TRH7. El efecto producido por el LPS sobre los niveles de TRH y PRL podría ser explicado sobre la base de que una respuesta de tipo inflamatoria, no requiere de estas hormonas para su activación, como sí ocurre en el caso de una respuesta de tipo IL-2-T-dependiente, sustentando la especificidad y el rol de este aumento en la respuesta T-dependiente.
Varios mecanismos podrían estar involucrados en la respuesta neuroendocrina a SRBC. Por una parte, citoquinas como por ejemplo la IL-2 (inducida sistémi-camente durante la expansión clonal de células T o producidas localmente en la pituitaria o en el SNC) podrían estar induciendo la expresión de TRH y/o PRL. Las células lacto/somatotrofas de la pituitaria expresan receptores a IL-210, y esta citoquina se ha observado in vitro que induce la síntesis de PRL en estas células, siendo inhibida por dopamina11. Por lo tanto, una combinación de una inhibición de dopamina y de estimulación de TRH podría estar actuando sobre la liberación de PRL. Dado que se observa un pico de PRL a las 2 h de haber sido los animales inmunizados, éste parecería ser demasiado temprano para ser atribuido a un aumento en la síntesis de citoquinas. Una posibilidad a considerar, podría ser vías nerviosas, que también podrían explicar los efectos sobre los niveles de ARNm de TRH como consecuencia de la inmunización. SRBC es procesado en el bazo, el cual se encuentra ampliamente inervado a través de vías nerviosas simpáticas y peptidérgicas. Además, fibras del núcleo paraventricular del hipotálamo se proyectan a la periferia a través de neuronas en la médula espinal. Apoyando esta idea, modificaciones en el recambio de norepinefrina en el hipotálamo12 así como de serotonina han sido descriptas luego de una inmunización con SRBC. Por último, podría considerarse la posibilidad que linfocitos T activados atravesaran la barrera hematoencefálica, pudiendo entonces actuar en el SNC13.
Durante el tiempo estudiado y a diferencia de la PRL, los niveles de TSH como de GH no evidenciaron ninguna modificación como consecuencia de la inmunización. Los patrones de secreción de PRL y TSH, luego de una estimulación por TRH, dependen de la vía de administración y de la dosis de TRH, así como del estado previo del hipotálamo y de la glándula pituitaria. Muchas evidencias experimentales avalan esta idea. Una posible explicación a esta respuesta diferencial podría atribuirse a una desensibilización del tirotrofo, dado que se ha demostrado recientemente que luego de una administraci? puls?il de TRH, los niveles de TSH se ven incrementados, pero este incremento no se mantiene luego de una administraci? continua de TRH14. La falta de cambios en la respuesta de TSH y GH a SRBC, podría reflejar la integración compensatoria de múltiples vías. La activación diferencial en la secreción de PRL, parecería estar relacionada entonces con su rol instrumental en la respuesta T-dependiente.
Ha sido recientemente demostrado que el gen de la preproTRH contiene una secuencia (178-199) que codifica para un péptido de 22aa, llamado factor inhibidor de la liberación de corticotrofina que inhibe la secreción de ACTH y debe proveer una clave en la regulación coordinada de las funciones de los ejes pituitario-adrenal y pituitario-tiroideo17. Este mecanismo podría explicar las diferentes respuestas del eje HPA en la respuesta inflamatoria T independiente y en la dependiente de células T. La expresión del gen de TRH durante la respuesta antigénica dependiente de células T podría ser no sólo instrumental en la activación del sistema inmune, sino también responsable de coordinar la inhibición del eje HPA durante la fase de activación temprana de la respuesta y su elevación en la fase tardía, cuando la expresión de TRH declina, controlando la expresión de los clones inespecíficos. Por lo tanto, en la expansión clonal dependiente de células T, la activación TRH/PRL es necesaria tempranamente, en tanto que más tardíamente es requerida la acción de los glucocorticoides; en cambio, en la respuesta inflamatoria (IL-1), la inhibición por glucocorticoides es inmediatamente necesaria.
Nuestros resultados proveen un nuevo concepto sobre el rol de TRH/PRL y el eje HPA durante el curso de la respuesta T-dependiente y validan la necesidad de estudiar específicamente antígenos T para comprender los mecanismos involucrados en la interacción funcional con el sistema neuroendocrino.

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TABLA 1.- Niveles de hormonas en plasma luego del tratamiento con SRBC. Los datos son expresados como promedio ± ES; **, p < 0.01; *, p < 0.05 (SRBC vs salina), n = 10 para cada condición, ANOVA con test de Scheffé’s.

Hormona Tratamiento 2 horas 7 días
(ng/ml)

salina 33.6 ± 17.4 9.8 ± 3.1
SRBC 36.6 ± 11.9 80.9 ± 33.9 *
salina 15.9 ± 9.2 4.7 ± 1.0
SRBC 10.5 ± 3.5 6.7 ± 3.2
salina 3.6 ± 0.5 4.5 ± 0.9
SRBC 7.9 ± 1.1 ** 4.5 ± 0.8
salina 2.2 ± 0.1 1.5 ± 0.2
SRBC 2.4 ± 0.3 3.2 ± 1.5
Corticosterona

GH

PRL

TSH

Fig. 1.- Determinación del título de anticuerpos anti-SRBC por ELISA. Los niveles de anticuerpos anti-SRBC, Ig(M+G) (DIANOVA, Hamburg, Alemania) diluido 1:1.000 en PBS 1x; IgM (Southern Biotechnology Associates, Inc, Birmingham, USA) diluido 1:1.000; IgG1 y IgG2a monoclonal de ratón anti-rata IgG2a y monoclonal de ratón anti-rata IgG1 (SERA-LAB, Sussex, Inglaterra) diluidos 1:2.000 en PBS, y revelados por un anticuerpo hecho en cabra (DIANOVA, Hamburg, Alemania) diluido 1:5.000 en PBS fueron determinados por duplicado en ratas conscientes y en movimiento inyectadas en forma intracerebroventricular (icv) con oligonucleótidos TRH-sentido y TRH-antisentido. Los datos son expresados como promedio ± ES de las densidades ópticas medidas por ELISA a 405 nm en diluciones del plasma 1/10 y 1/100. Las densidades ópticas provenientes del plasma de animales inyectados icv con vehículo no difieren en forma significativa del grupo tratado con TRH-sentido (no mostrado). La respuesta a anticuerpos anti-SRBC es espec?ica para animales inmunizados intraperitonealmente (ip) con SRBC, pero no para animales inyectados ip con soluci? salina. ***, p < 0.0001; **, p < 0.01; *, p < 0.05 (TRH-antisentido vs los correspondientes TRH-sentido), ANOVA con test de Scheff?s.