Juan José Poderoso, María Cecilia Carreras, Costanza Lisdero, Francisco Schöpfer, Natalia Riobó, Jorge Peralta

Laboratorio de Metabolismo del Oxígeno, Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Key words: shock, mitochondria, neutrophils, nitric oxide, superoxide anion, peroxynitrite

Resumen

El síndrome de shock ha sido descripto en forma clásica como el producto de la disminución de la perfusión tisular y la disponibilidad de O2; sin embargo, en algunos tipos de shock como el séptico o el traumático ambos pueden hallarse aumentados en algunas circulaciones regionales. Hace ya una década se han descripto alteraciones mitocondriales consistentes en un desacoplamiento de la fosforilación oxidativa en el shock endotoxémico y hemorrágico experimentales y en el ser humano. Recientemente, el descubrimiento del óxido nítrico (NO) y su aumento en los estados de shock, ha abierto nuevas perspectivas en la comprensión del problema. El NO produce vasodilatación y al mismo tiempo, determina un aumento en la producción mitocondrial de especies activas del O2, como del anión superóxido. Ambos radicales reaccionan entre sí y pueden formar otro oxidante con capacidad para nitrar residuos fenólicos de las proteínas: el peroxinitrito. Este efecto conlleva una alteración de la funcionalidad de diferentes enzimas mitocondriales como la succinato deshidrogenasa y la ATPasa y conduce a la disfunción mitocondrial, a una disminución de los niveles de compuestos de alta energía y a la insuficiencia multiorgánica. El aumento de la liberación de NO se debe al efecto de péptidos circulantes y de neutrófilos adheridos al endotelio y a la inducción por mediadores inflamatorios, como el TNF-a y las interleuquinas, de la NOS inducible (iNOS) en el endotelio y los tejidos. Se propone que el estado de shock es la consecuencia de un disbalance entre el NO y el O2 y sus metabolitos.

Abstract

Shock: concepts towards a definition. The shock syndrome has been classically considered as a consequence of both decreased tissue perfusion and O2 supply; however, in some types of shock like septic or traumatic ones, regional blood flows may be increased. A decade ago, mitochondrial alterations consistent with uncoupling of oxidative phosphorylation were reported in either endotoxemic or hemorrhagic experimental shock or in humans. Recently, the discovery of nitric oxide (NO) and its increase in the shock state, has opened new perspectives in the understanding of this problem. Nitric oxide produces vasodilatation and, at the same time, increases the mitochondrial production of O2 active species like superoxide anion. Both radicals react to form a strong oxidant that is able to nitrate the phenolic rings of proteins: peroxynitrite. This effect leads to the impairment of the activities of different mitochondrial enzymes like succinate dehydrogenase and ATPase and the mitochondrial function and finally, to decreased energy levels and to multiorgan failure. The increase in NO release is due to the effects of circulating peptides and of increased adhesion of neutrophils to the endothelium and to the positive effects of inflammatory mediators like TNF-a and cytokines on inducible NOS (iNOS) expression in endothelium and tissues. It is suggested that the shock state is the consequence of an imbalance between NO and O2 and their metabolites.

Dirección postal: Dr. Juan José Poderoso. Laboratorio de Metabolismo del Oxígeno, Hospital de Clínicas José de San Martín, Avda. Córdoba 2351, 1120 Buenos Aires, Argentina. Fax: 54 -1- 961-6148. E-mail: jpoderos@fmed.uba.ar

El sindrome de shock ha sido definido en forma genérica como la expresión de un defecto de la perfusión tisular. Sin embargo, esta definición tiene algunas limitaciones como el hecho que trastornos discretos de la perfusión tisular (por ej. producidos por arritmias o hipotensión transitoria) no conducen a un estado crítico con gran potencial letal como el shock y que en algunos tipos de shock es difícil estimar el grado de perfusión tisular. Con más precisión, el shock puede ser considerado como el resultado de un déficit sostenido de producción de compuestos de alta energía provocado por diferentes causas. El déficit de energía y el deterioro de las funciones tisulares pueden originarse en fallas de aporte de O2 y nutrientes y de remoción de metabolitos como lactato, o en fallas de utilización de los mismos por defectos intracelulares. De este modo, el sindrome de shock ha quedado ligado al metabolismo del O2. La captación de O2 en organismos unicelulares primitivos se hace por difusión de acuerdo a la ecuación :
captación O2 =
= pO2 extracelular - pO2 intracelular x distancia2

A medida que los organismos aumentaron su complejidad y su tamaño, se hizo necesaria la aparición de un sistema convectivo que acerque el O2 a todas las células y este es el sistema circulatorio-pulmonar, aunque el principio de la difusión y captación de O2 en el nivel celular se guía por los mismos principios que en los organismos unicelulares. Un individuo de 70 Kg de peso dispone de un litro de O2 por minuto y consume en reposo una cuarta parte. Un defecto en la captación tisular del O2 puede ser provocado por la disminución del O2 disponible por falla circulatoria. En otros casos, el O2 disponible puede ser relativamente aceptable pero la utilización del mismo puede alterarse como resultado de una falla celular o mitocondrial. En muchas situaciones, una falla circulatoria inicial puede provocar un defecto celular ulterior. De acuerdo a los expuesto, las causas más comunes de shock con disminución del O2 disponible son la hemorragia profusa con pérdida de más del 25% de la volemia, la deshidratación, la acidosis diabética, la falla cardíaca principalmente por infarto agudo de miocardio y la anafilaxia. El shock séptico, traumático y asociado a cirugía y a la pancreatitis aguda son, por el contrario, ejemplos de shock con disponibilidad de O2 relativamente conservada.
Recientemente, se ha incorporado el óxido nítrico (·NO) a la fisiología circulatoria. El ·NO es un vasodilatador y regulador del consumo de O2 mitocondrial1, 2. De acuerdo con la teoría endosimbionte, las mitocondrias son bacterias modificadas y las bacterias primitivas pueden producir ·NO en el proceso de nitrificación-denitrificación 3. La liberación de ·NO y las concentraciones de O2 son antagónicas ; la falla circulatoria puede, en fin, aumentar el ·NO y disminuir el O2, como ocurre en organismos facultativos micro-aerófilos. Desde este punto de vista, hoy, el shock podría definirse como un desbalance entre el metabolismo nitrogenado y el metabolismo del O2 y sus metabolitos.
En los párrafos siguientes, desarrollaremos un análisis de los elementos que integran causas y consecuencias en el concepto de esta definición.

La mitocondria

Las mitocondrias son pequeñas organelas intracelulares presentes en el citoplasma de las células aeróbicas que se caracterizan por tener un alto grado de autonomía tanto genética como metabólica. Las mitocondrias han sido esenciales en la evolución de las células eucarióticas principalmente par la energía que generan a partir de la oxidación del piruvato a CO2 y la reducción del oxígeno molecular a H2O. Las mitocondrias ocupan un espacio significativo del volumen citoplas-mático de las células eucarióticas y están formadas por dos membranas altamente especializadas que delimitan dos compartimentos: la matriz interna y el espacio intermembrana (Fig 1 ). La membrana interna contiene las enzimas que catalizan el transporte de electrones desde precursores reducidos hasta el O2 con producción de H2O. La secuencia de reacciones de óxido-reducción ordenada en función de los respectivos potenciales electroquímicos de pares determinados libera energía que es almacenada en el compuesto de alta energía ATP a partir de ADP y Pi en la fosforilación oxidativa, un proceso enzimático catalizado por la ATP sintetasa. La transferencia de electrones y la fosforilación oxidativa se hallan acoplados de tal modo que un aumento del ADP (al disminuir el ATP) estimula la velocidad del transporte de electrones y en forma simultánea la síntesis de ATP4.
Por otro lado, una pequeña parte del O2 consumido (2-5%) en las mitocondrias puede conducir a la formación de radicales libres del O2 como el anión superóxido (O2-) y sus productos5. Desde hace muchos años se sabe que el antibiótico natural antimicina bloquea la transferencia de electrones desde el ubiquinol de las membranas mitocondriales a los citocromos b y c y concomitantemente provoca un aumento de la producción de especies activas del oxígeno (O2- y su producto de dismutación, peróxido de hidrógeno o H2O2)6, 7. La producción de anión superóxido surge a partir de una reducción unielectrónica directa del O2 por oxidación de la ubisemiquinona intermediaria (UQ-.)8 y fue descripta por primera vez 25 años atrás cuando se establecieron las bases moleculares que justifican a las mitocondrias como la principal fuente de radicales libres de la célula en aerobiosis9.

Mitocondrias y shock

Desde hace varios años diferentes autores sugirieron la participación mitocondrial en los estados de shock. Mela y Shumer y colaboradores describieron alteraciones mitocondriales en el shock endotóxico y hemorrágico experimental10,11 en hígado, cerebro y músculo esquelético consistentes en una disminución del flujo de electrones y desacoplamiento de la fosforilación oxidativa. La intensidad de los hallazgos fue dependiente del tiempo de exposición a la noxa causal. Las alteraciones mitocondriales fueron atribuidas a un aumento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial al calcio y fueron parcialmente revertidas por dexametasona. En nuestro medio hemos descripto alteraciones similares en mitocondrias de músculo e hígado de rata en la peritonitis experimental12,13 y, una década atrás en esta misma publicación, en el músculo esquelético humano durante el shock séptico14. Por otro lado, estudios preliminares en el diafragma de rata en la endotoxemia, han mostrado un desacoplamiento similar de la fosforilación oxidativa. En otros tejidos como el hígado, la disfunción mitocondrial se manifiesta por un aumento inicial de la velocidad de transporte de electrones que indica el primer grado de las alteraciones en el proceso de fosforilación oxidativa15. Las alteraciones mitocondriales en la captación de oxígeno y la producción de energía se asocian a una mayor producción de radicales libres del oxígeno luego de la estimulación con antimicina, hecho que hemos observado en la sepsis experimental en ratas12,13. Algunas citoquinas como el TNF-a pueden producir una disminución del control respiratorio mitocondrial, lo que se ha vinculado con un aumento de la producción de especies activas del O2 por las organelas16.

Neutrófilos e inflamación

El reclutamiento y la activación de linfocitos y leucocitos fagocíticos son importantes componentes de la inflamación. Los leucocitos polimorfonucleares humanos o neutrófilos son células granulocíticas derivadas de la serie mieloide que constituyen la primera línea de defensa contra bacterias y parásitos en las reacciones inflamatorias, juegan un rol central en los mecanismos de defensa inespecífica del huésped17. La ingestión de los agentes iniciadores del proceso inflamatorio por los fagocitos y la generación de productos tóxicos como enzimas proteolíticas, especies reactivas del oxígeno, óxido nítrico y proteínas catiónicas, son responsables de la destrucción del agente agresor así como también del tejido del huésped. La activación de la respuesta inmune conduce a la eliminación de los antígenos involucrados sin producir evidencias clínicas de inflamación debido a que los agentes responsables de la misma son rápidamente removidos y se atenúa la producción de mediadores inflamatorios. Si esto no ocurre, se produce una activación crónica leucocitaria que lleva a la destrucción tisular característica de diversas enfermedades inflamatorias.
El proceso de fagocitosis incluye: la migración e ingestión, la degranulación, el estallido respiratorio y la respuesta a las citoquinas y su producción.
El primer paso en el reclutamiento de los neutrófilos en el sitio de inflamación es la detección del proceso inflamatorio, ya sea por la percepción del gradiente de la moléculas quimioatractantes o por la unión a moléculas de adhesión presentadas por las células endoteliales18. Los péptidos quimioatractantes se originan en el sitio de inflamación, tanto a partir de la activación del complemento como de la liberación de productos bacterianos, incluyendo los formil oligopéptidos. Los quimioatractantes lipídicos son generados por las células endoteliales activadas por citoquinas así como también por los propios neutrófilos en un proceso de retroalimentación positiva, y median las actividades inflamatorias locales y el reclutamiento de los neutrófilos al sitio de inflamación.
La locomoción y la actividad fagocítica ocurren principalmente en los tejidos. Para salir de la circulación y entrar a los tejidos, los neutrófilos se adhieren a las paredes del vaso y migran a través del endotelio vascular14. La transmigración incluye múltiples estados de interacción entre los receptores de superficie y las enzimas del neutrófilo con las moléculas de las células endoteliales y de la membrana basal. Los neutrófilos circulantes, en el estado inactivado, tienen receptores quimiotácticos, moléculas de adhesión y carbohidratos de superficie. El paso siguiente en la transmigración es una interacción débil y reversible con la línea de células endoteliales de los vasos sanguíneos, particularmente en las vénulas post-capilares. En cualquier momento, existe un porcentaje pequeño de neutrófilos que abandonan la circulación fluida y ruedan a lo largo del endotelio, retornando luego a la circulación. La P-selectina (CD62) es el miembro más importante para la adhesión del neutrófilo, está localizada en los gránulos a de las plaquetas y en los cuerpos de Weibel-Palade de las células endoteliales. La activación del endotelio por las citoquinas inflamatorias como interferón-g (IFN-g) , IL-1b y factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), causa una rápida expresión de P-selectina. La adhesión primaria permite a los neutrófilos censar la producción periférica de quimioatractantes, los cuales, a su vez, facilitan la orientación de los neutrófilos y su activación y potencian su adhesividad por la activación funcional y cuantitativa de las integrinas, conocidas como complejos CD11-CD18. El principal contrarreceptor de las integrinas en las células endoteliales son las moléculas ICAM (1 y 2), las cuales inducen una adhesión firme de los neutrófilos al endotelio (adhesión secundaria) requerida para la posterior transmigración. Otras moléculas de adhesión importantes durante la transmigración son las PECAM-1 endotelial y del neutrófilo.
La liberación de enzimas líticas de los gránulos secretorios (colagenasa, elastasa, gelatinasa e hidrolasas) frente a concentraciones bajas de quimioatractantes, perfora la membrana basal y permite el pasaje de los neutrófilos hacia el sitio de invasión microbiana donde se produce la fagocitosis.
La interacción de los quimioatractantes como formil péptidos (fMLP), C5a (anafilotoxina liberada durante la activación del sistema de complemento), PAF (factor activador plaquetario), IL-8 y opsoninas con receptores específicos de la membrana plasmática de los leucocitos producen una serie de reacciones bioquímicas que resultan en el ensamblado y la activación del sistema NADPH oxidasa asociado a membrana, el cual es responsable de la generación de metabolitos del oxígeno19,20. Los cuales incluyen el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno, el radical hidroxilo y el ácido hipocloroso. Estas especies son poderosos oxidantes y rápidamente atacan una amplia variedad de moléculas, incluyendo aminas, tioles, tioésteres y nucleótidos. Recientemente, se ha demostrado que los neutrófilos activados generan simultáneamente óxido nítrico y anión superóxido durante el estallido respiratorio, lo cual resulta en la formación de peroxinitrito como producto de reacción entre ambos radicales21.
Tanto el H2O2 y los compuestos cloramínicos (derivados de la acción de la mieloperoxidasa sobre Cl-/H2O2) como el .NO o el peroxinitrito son capaces de producir la muerte bacteriana, ya sea por la secreción de estos productos al medio o al fagosoma, una vez que se ha producido la fagocitosis de los organismos agresores22.
La liberación del contenido de los gránulos y la generación de compuestos oxidantes ocurre simultáneamente. Los gránulos liberan péptidos como la defensina y la proteína aumentadora de la permeabilidad (BPI) que tienen acción tóxica directa sobre las bacterias y otras moléculas como la lactoferrina y la proteína ligadora de vitamina B12 que pueden privar a las bacterias de algunos nutrientes esenciales. El funcionamiento normal de los mecanismos proteolíticos y oxidativos son cruciales para la defensa del huésped frente a organismos invasores.

La interacción endotelio-células circulantes-neutrófilos

Las interacciones entre el endotelio y los leucocitos circulantes se hallan mediadas por las llamadas moléculas de adhesión y constituyen el primer paso en la migración de estas células hacia los tejidos (Fig 2 ). Estas moléculas regulan el tráfico de leucocitos a través de la barrera endotelial en la respuesta inflamatoria. El mecanismo básico de interacción entre el endotelio y los leucocitos incluye diferentes familias de moléculas específicas en las células involucradas que actúan como receptores de adhesión. Como se ha mencionado, una de esas familias en los leucocitos es la de las integrinas que comprende glicoproteínas heterodiméricas formadas por subunidades a y b respectivamente identificadas como receptores CD11(a,b,c)/CD18; otra importante familia de integrinas recientemente involucrada en los procesos de trombosis es la gpIIb/IIIa. La segunda familia de moléculas de adhesión son las selectinas que se expresan en el endotelio (E-selectina), en leucocitos (L-selectina) y en plaquetas (P-selectina). Finalmente, el tercer grupo lo constituyen las moléculas intracelulares de adhesión o ICAM-1 e ICAM-2 una superfamilia de gamma globulinas que se halla en los endotelios y en otras células como los linfocitos. Recientemente, ICAM-1 se ha hallado también en neutrófilos humanos. Las moléculas de adhesión pueden estar presentes en forma permanente o constitutiva en las células o ser inducidas por diferentes efectores. ICAM-l es inducida en el endotelio por LPS y citoquinas como TNF a e IL-1, así como por trombina y ésteres de forbol. Las integrinas CD11/CD18 se activan en el neutrófilo por cambios estructurales y conformacionales, por C5a y TNF-a, IL-1 e IL-8. La producción endotelial de O2- y H2O2 puede asimismo activar la adhesión de neutrófilos vía CD18. Por el contrario, el ·NO es capaz de inhibir la up-regulation de la expresión de CD18 provocada por las citoquinas y consecuentemente, inhibir la adhesión y agregación leucocitaria. El hecho capital del proceso de adhesión probablemente está relacionado con la interacción CD11/CD18 e ICAM-l. El uso de anticuerpos anti CD11/CD18 y anti ICAM-1 demuestra que ambos receptores colaboran en forma aditiva en la adhesión, dependiendo del tipo de CD11 involucrado (a,b ó c). La unión de CD11/CD18 del neutrófilo al ICAM-1 endotelial se haría a través de los amino terminales de este último.

Alteraciones del neutrófilo y shock

Se han descripto numerosas alteraciones de los mecanismos descriptos en el shock y en mecanismos de isquemia-reperfusión. Los neutrófilos de sujetos normales sometidos a isquemia muscular esquelética aumentan la producción de superóxido, consecutivamente a la activación endotelial23. Yodice y colabs. han señalado que las interacciones entre ICAM-1 e integrinas bajo estímulo con IL-l aumentan en condiciones de bajo flujo favoreciendo la adhesión de los neutrófilos24. La IL-8 aumenta la producción de radicales libres de los neutrófilos en la sepsis en el humano y en el animal de experimentación; en concordancia, la administración de anticuerpos anti IL-8 mejora las condiciones hemodinámicas y la sobrevida de conejos tratados con endotoxina25. En estas condiciones, el aumento de la producción de radicales libres y de la adhesión de los neutrófilos en la endotoxemia han sido considerados como factores causales de la aparición de disfunción miocárdica y daño pulmonar26. El daño pulmonar probablemente está ligado al importante secuestro leucocitario; algunos mecanismos compensatorios tienden a disminuir estos efectos como la disminución de la expresión de integrinas posteriores a la administración de IL-8.25. La disminución de la contractilidad miocárdica ha sido apreciada en elegantes experiencias en las que corazones de conejos con endotoxemia fueron perfundidos con sangre filtrada sin neutrófilos y en los que no se observaron cambios en las variaciones de tensión parietal isovolumétrica por unidad de tiempo (dP/dt (max)), mientras que disminuyó 74% en quienes recibieron sangre con neutrófilos. Desde hace varios años, los investigadores en circulación coronaria han vinculado a la infiltración neutrófila en las áreas de isquemia miocárdica como causales de la progresión del proceso de daño celular. Las alteraciones del endotelio coronario pueden promover la migración leucocitaria a las áreas isquémicas. Kapoor y colabs.27 demostraron recientemente que la disminución del pool de neutrófilos puede atenuar los efectos del shock hemorrágico en perros. En el humano, el aumento de la deformabilidad de los neutrófilos en la sepsis y el shock séptico ha sido aceptado como causa de obstrucción microvascular24; en consonancia, la inhibición de la síntesis de ·NO puede aumentar el depósito de neutrófilos y el daño celular en el hígado y el pulmón de ratas con shock hemorrágico28. La expresión de las integrinas se halló aumentada en pacientes con shock traumático 6 a 12 hs después del trauma, lo que se correlacionó con el grado de acidosis metabólica en esta situación29. La participación de selectinas fue estudiada por Hansbrough y colabs en ratas con shock por quemaduras a través de la administración de anticuerpos antiselectinas que bloquearon la deposición pulmonar de neutrófilos en los pulmones y riñones, aunque sin afectar la producción de peróxido de hidrógeno por estas células30. Por otro lado, no se ha establecido la progresión temporal del efecto de diferentes tipos de shock sobre el estallido respiratorio de los neutrófilos. Algunos autores han hallado un aumento del burst oxidativo en ratas con shock por quemaduras. Rose y colabs. hallaron diferencias luego de determinar durante 14 ds. consecutivos el estallido respiratorio de neutrófilos de pacientes con shock séptico y hemorrágico31. En los primeros, se verificó una disminución de la producción de superóxido y en los segundos, un aumento inicial seguido de una disminución posterior. En nuestro medio, Carreras y colabs. demostraron una disminución de la producción de ·NO y O2- por los polimorfonucleares de pacientes con sepsis grave32; quizás, esta sea una manifestación de un aumento de la apoptosis de las células, una vez desencadenado el mecanismo inflamatorio. En realidad, y dado que los neutrófilos humanos producen peroxinitrito (ONOO-) por reacción inmediata del O2- con el ·NO, los efectos deletéreos de los neutrófilos (inclusive contra ellos mismos) pueden deberse a este poderoso oxidante; como se ha mencionado precedentemente, se ha demostrado la presencia de ONOO- en los fagosomas de neutrófilos. Finalmente, la migración excesiva, el depósito tisular, la liberación de oxidantes y de proteasas por los neutrófilos ocupan un espacio en la patogénesis de shock.

El óxido nítrico

El óxido nítrico (·NO) es uno de los metabolitos biológicamente activos más pequeños. Debido a su bajo peso molecular y a su naturaleza lipofílica, el ·NO difunde rápidamente a través de las membranas de las células eucarióticas y de las paredes celulares de las células procarióticas33-36. El ·NO es producido y actúa sobre casi todas las células del organismo. La magnitud y la duración de la síntesis de ·NO por las células determina que su acción sea fisiológica o patológica. Las acciones fisiológicas son mediadas por pulsos de pequeñas cantidades de ·NO, las cuales pueden aumentar los niveles de cGMP a través de la nitrosilación del hemo de la guanilil ciclasa, produciendo la dilatación de los vasos sanguíneos, la desagregación plaquetaria y la apertura y cierre de algunos canales iónicos. Los efectos patológicos son el resultado de una producción sostenida y aumentada de ·NO, que puede inactivar enzimas dependientes de hierro involucradas en la respiración celular, en la producción de energía y en la replicación celular. En altas concentraciones, ·NO interacciona con diferentes moléculas blanco, incluyendo aquellas que responden a bajos niveles de ·NO como la guanilil ciclasa. Las óxido nítrico sintetasas (NOS) catalizan la oxidación de uno de los dos nitrógenos guanidínicos equivalentes de la L-arginina, aminoácido semiesencial, para producir ·NO y L-citrulina37. Otros cosustratos requeridos son el O2 y el NADPH. La formación de ·NO ocurre en dos pasos y consiste en la oxidación de uno de los N del grupo guanidínico de la L-arginina para producir N-hidroxi-L-arginina, y ulteriormente ·NO. Con este propósito, existen dos tipos de isoformas de la NOS, una constitutiva de baja producción y otra inducible de alta producción de ·NO. Las células que presentan la enzima constitutiva, como las neuronas y las células endoteliales (cNOS y eNOS), responden a agonistas que elevan el Ca2+ intracelular. En contraste, la activación de la NOS inducible (iNOS) se produce a nivel transcripcional. El ·NO formado puede actuar dentro de la célula en la cual es generado o difundir a las células adyacentes. Algunos efectos del ·NO, como los efectos citotóxicos, son independientes de cGMP y se deben a la interacción directa del ·NO con un grupo prostético hemo. El ·NO interacciona con el centro Fe-S de la aconitasa o de algunas enzimas de la cadena mitocondrial de transporte de electrones como la NADH-deshidrogenasa o la succinato-deshidrogenasa alterando el metabolismo energético y la respiración celular1. También actúa sobre la citocromo oxidasa ( IE50 = 0.1 µM ·NO)1,2 y la ribonucleótido reductasa inhibiendo la replicación celular. Hay evidencias recientes basadas en estudios de inmunohistoquímica acerca de una localización de la NOS en las membranas internas de la mitocondria colocalizando con la succinato deshidrogenasa38 y de actividad de NOS en mitocondrias aisladas de hígado39. Este hecho resulta significativo desde que una producción directa de ·NO sobre la mitocondria ejercería un estricto control de la respiración celular y de la producción de radicales libres del O240. Recientemente hemos demostrado que la adición de ·NO a mitocondrias o partículas submitocondriales aisladas aumenta considerablemente la producción de especies activas del O2 no obstante el efecto “cianuro” que posee el ·NO1. En este sentido, la adición de cianuro a las mitocondrias no produce un aumento definido en la producción de radicales libres y, por lo tanto, el ·NO estimula esta producción de radicales a través de una interacción en otro segmento de la cadena de transporte de electrones. El efecto no podía ser atribuído solamente a una inhibición de los citocromos b, como en el caso de la antimicina, que aumenta la producción de anión superóxido. Como consecuencia de esta evidencia experimental, hemos confirmado la presencia de una reacción entre el ubiquinol y el ·NO, una reacción que podría explicar los datos experimentales obtenidos de la fisiología mitocondrial (Fig 3). La producción de O2 por las mitocondrias en respuesta a la presencia de ·NO puede constituir un mecanismo regulatorio mitocondrial para controlar la concentración intramitocondrial de ·NO y sus efectos sobre la captación de O2 (Fig 4 ).
Oxido nítrico y shock

La administración de endotoxina promueve una rápida disminución de la presión arterial y de la respuesta presora a norepinefrina que son atenuadas por la administración de inhibidores de la óxido nítrico sintasa como L-NAME y L-NMMA41. El efecto de la endotoxina puede ser debido a la activación de la NOS constitutiva como la eNOS y de la iNOS inducible42. En el primer caso, la activación puede ser debida a liberación de bradiquinina, PAF o angiotensina II y no se suprime por dexametasona mientras que en el segundo, la expresión de iNOS es secundaria a la cascada inflamatoria, particularmente al efecto de TNF-a e IL-1, IL-6 e IL-8 que actúan en el endotelio y en tejidos específicos como el hígado y el miocardio43. Estos efectos pueden ser bloqueados por inhibidores de la NOS y por dexa-metasona. La depresión miocárdica provocada por la endotoxemia es también mediada por las mismas citoquinas; aunque también se han publicado interpretaciones opuestas44. En estudios en humanos se ha observado una mejoría de la hipotensión arterial luego del tratamiento con L-NMMA45. El shock hemorrágico también es una causa de disfunción de diferentes órganos y distress respiratorio del adulto. Si bien en las primeras etapas la respuesta adrenérgica mantiene un importante grado de vasoconstricción, en los períodos finales se observa vasodilatación y el shock se hace refractario como bien describiera Wiggers hace ya muchos años. Existe ya suficiente evidencia acerca de que en los períodos finales del shock hemorrágico hay una activación de la cascada inflamatoria. La aparición de TNF-a puede ya observarse en los primeros 30 minutos de hipotensión hemorrágica. En parte, estos efectos pueden deberse a la endotoxemia que sigue a la translocación bacteriana y/o a reclutamiento y activación del sistema macrofágico per se. En favor de lo segundo, es destacable que no se ha observado un nivel sostenido y significativo de endotoxemia en diferentes modelos de shock hemorrágico. Consecuentemente, se ha observado disminución de la depresión miocárdica y un aumento de la sobrevida en el shock hemorrágico experimental luego de la administración de anticuerpos anticitoquinas o del receptor antagonista de IL-l. El aumento de ·NO en el shock hemorrágico puede ser medido en la sangre de pacientes por estudios de espectroscopía de resonancia paramagnética (EPR). Del mismo modo que en el shock endotóxico, el aumento de ·NO en el shock hemorrágico estaría asociado a activación de eNOS y iNOS en forma secuencial en las primeras etapas por activación endotelial por autacoides y en las últimas por la inducción provocada por las citoquinas circulantes. Sin embargo, la aparición de hipotensión refractaria en el shock hemorrágico es previa a la inducción de iNOS y algunos autores no han hallado en forma sistemática cambios en la expresión o actividad de iNOS aunque se han propuesto tratamientos basados en dicha respuesta46.

Interacciones óxido-nítrico-anión superóxido: peroxinitrito

Hace algunos años, Beckman postuló las importancia de la reacción entre el ·NO y el anión superóxido (O2-) como causa de efectos deletéreos en las células47. La reacción entre los dos radicales es :

NO + O2- ® ONOO-
La reacción conduce a la formación de un poderoso oxidante, el peroxinitrito, que produce la nitración de restos fenólicos como los residuos de aninoácidos tirosina y triptofano48,49. Este hecho conduce a la inactivación de enzimas mitocondriales como la aconitasa, NADH deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa50,51 y, consecuentemente, a alteraciones en la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Recientemente, hemos detectado peroxinitrito con anticuerpos específicos antinitrotirosina por la técnica de Western blot en diferentes tejidos como el diafragma, en el que la iNOS se halla expresada en la endotoxemia52. En nuestra experiencia la administración previa de L-NMMA previene parcialmente esta nitración.
Tanto en la isquemia-reperfusión como en la sepsis, existen condiciones que favorecen la formación de peroxinitrito. El aumento de 10 veces en la concentración de superóxido y de óxido nítrico puede aumentar 100 veces la concentración de peroxinitrito. El peroxinitrito ha sido detectado en el pulmón en el distress respiratorio del adulto, en los neutrófilos y en el endotelio. Como ya fue mencionado, el ·NO está en nuestra opinión conectado a la producción mitocondrial de anión superóxido1. En condiciones normales, este puede ser un mecanismo fisiológico de regulación de los niveles mitocondriales de óxido nítrico (Fig 4). Cuando las concentraciones intramitocondriales de óxido nítrico aumentan, como resultado de la presencia de iNOS, el aumento de la concentración del estado estacionario de peroxinitrito puede determinar la nitración de enzimas mitocondriales, incluyendo la ATPasa y, en consecuencia, afectar el flujo de electrones y la síntesis de ATP.

El daño en el shock : un mecanismo integrado multicausal

De acuerdo a lo expuesto, los diferentes hechos descriptos se correlacionan con la evolución y el cuadro sintomático del shock. La hemorragia severa, la falla cardíaca, la sepsis, el trauma y la pancreatitis comparten una vez iniciados la liberación de péptidos vasoactivos y activan la producción de citoquinas. Este hecho determina una disfunción endotelial53,54 con aumento de moléculas de adhesión y secuestro y agregación de los neutrófilos circulantes. Ambos endotelio y neutrófilos producen óxido nítrico y anión superóxido y contribuyen a dañar más aún los vasos sanguíneos. Tal vez un poco más tarde la inducción de iNOS libera grandes concentraciones de ·NO que estimula la producción de anión superóxido en las mitocondrias. Las elevadas concentraciones de O2- y ·NO producen la formación de peroxinitrito que puede alterar tanto el mecanismo contráctil vascular como la función mitocondrial y conducir a una condición de severa alteración funcional de los diferentes sistemas (falla multiorgánica) y al estado de hipotensión irreversible (Fig 5).

Bibliografía

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Fig 1. Estructura de la mitocondria
Fig 2. Esquema de las acciones del óxido nítrico sobre la cadena de transporte de electrones mitocondrial

Fig 3. Activación e interacciones de las moléculas de adhesión
Fig 4. Efectos regulatorios del óxido nítrico en la respuesta vascular y el metabolismo celular
Fig 5. Posibles mecanismos integrados de daño en el shock