RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES ORALES

ENDOCRINOLOGIA IV - CITOQUINAS Y OXIDO NITRICO
Coordinadores: A Seilicovich, V Rettori

131. Efecto de la l-arginina en la modulacion de la esteroi-dogenesis en zona fasciculata adrenal de rata. C Cyme-ryng, Laura Dada, R Rosenstein, C Mendez, C Colonna, I Tamolunas, E. Podestá.
Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Resultados previos indican que el óxido nítrico (NO) producido por generadores externos ejerce un efecto inhibitorio en la esteroidogénesis adrenal basal y estimulada por ACTH. En el presente trabajo demostramos que el NO generado endógenamente a partir de L-arginina por la NO sintasa (NOS) ejerce un efecto inhibitorio sobre la biosíntesis de corticosterona (ng corticosterona/105 cél: control: 6.24±0.22; L-Arg 2.5 mM: 5.12±0.24; ACTH: 127.61±3.46; ACTH + L-Arg: 91.88±2.5, n=4). La actividad de NOS se demostró por el incremento en la producción de nitritos, producto del catabolismo del NO, y de GMPc, via la activación de una guanilato ciclasa soluble. Se caracterizó además el mecanismo de captación de L-Arg por células de zona fasciculata determinándose un Km de 103 mM y una Vmax de 97 pmoles/min/105cel. L-ornitina, L-Lis, pero no D-Arg inhibieron la captación (35±2, 44±1 y 12±2 respect., n=3) confirmando la estereoespe-cificidad del proceso de transporte. Un posible sitio de acción para el NO generado endógenamente sería a nivel del citocromo P450 scc, dado que el efecto inhibitorio de la L-Arg se observa cuando la esteroidogénesis es estimulada por 8Br-AMPc y 22R-OH colesterol pero no por pregnenolona. Los resultados sugieren la participación de una actividad endógena de NOS en la modulación de la esteroidogénesis adrenal.

132. Caracterizacion de la enzima oxido nitrico sintasa (NOS) en zona fasciculata (ZF) adrenal. Laura.Dada, C Cymeryng, C Finkielstein, C Colonna, M Cornejo Maciel, E Podestá.
Departamento Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia y caracterizar la actividad de la NOS en células de ZF adrenal. La actividad enzimática fue evaluada en células aisladas de ZF de adrenal de rata por la conversión de L-[3H]arginina a L-[3H]citrulina. La formación de L-[3H]citrulina (0.45±0.06 pmol/min/105 células) fue dependiente de la presencia en el medio de reacción de NADPH, FAD, Ca2+ y tetrahidrobiopterina siendo inhibida significativamente por trifuoroperazina y los análogos de arginina, L-NAME y L-NNA (% inhibición: 46±3; 80±4; 95±6 respectivamente), inhibidores de la enzima. A partir de ARN total de ZF y de la línea de tumor adrenocortical Y1 de raton se realizó un RT-PCR utilizando primers específicos para la amplificación de las isoformas NOS 3 (endotelial) y NOS 1(neuronal). Estos primers amplifican fragmentos de 585 y 890 pb respectivamente. Sólo se amplificó una banda del tamaño esperado con los primers de la NOS 3. El fragmento amplificado a partir de ZF resultó un 93% homólogo con la NOS 3 de ratón. Inmunoblots revelados con anti-NOS(3) indicaron la presencia de una banda de 150 kDa, tanto en zona fasciculata como en células Y1. Los resultados indican la presencia de una actividad de NOS en zona fasciculata de rata que posiblemente corresponda a la isoenzima NOS 3.

133. Posible participación del óxido nítrico (NO) en la regulación funcional de la célula de Sertoli. Silvina Meroni1, Angela Suburo2, Selva Cigorraga1.
CEDIE, Hospital de Niños R. Gutiérrez1; Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral2, Buenos Aires.

El NO actúa como señal intra y extracelular en distintos tejidos. El objetivo de este trabajo fue estudiar la participación del NO en la regulación funcional de la célula de Sertoli. En cultivos de células de Sertoli provenientes de ratas de 20 días de edad se detectó la actividad de NADPH diaforasa, que indica la presencia de una o más isoenzimas de la NO sintasa (NOS). Los cultivos fueron estimulados por tres días con liberadores de NO [nitroprusiato de sodio (NP), 1mM y S-nitroso-N-acetil penicilamina (SNAP), 1mM]. Ambos tratamientos estimularon la actividad de g-glutamiltranspeptidasa (gGTP) (B:19,2±2,1; NP:34,0±1,4*; SNAP:39,2±4,1*, pmol/µgDNA/min) y la producción de lactato (B:7,6±0,7; NP:36,9±2,6*; SNAP:72,2±6,7*, µg/µgDNA) (X±DS, n=3, * p< 0,01 vs B). La IL1ß produjo los mismos efectos y además aumentó los niveles de nitritos en el medio de cultivo. Esta última acción de IL1ß fue bloqueada por inhibidores de NOS (aminoguanidina, 1mM y L-NAME, 5mM). Se concluye que el NO podría participar en la regulación funcional de las células y que la IL1ß podría utilizar este sistema de señales.

134. Rol de NFkB y su interacción regulatoria con glucocor-ticoides en la apoptosis inducida por TNF-a. Mónica A. Costas, Lionel Müller Igaz, Paola Plazas, Eduardo Arzt.
Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires

La acción antiinflamatoria de los glucocorticoides (GC) se explica a nivel molecular a través de una interacción física entre el receptor de GC y el factor de transcripción NF6B inducido por citoquinas (ej. TNF-a), ó bien vía la inducción del factor inhibidor de NFkB, IkB, por GC. Hemos demostrado que los GC inhiben la apoptosis inducida por TNF-a en las células L-929. Sin embargo, en este modelo se desconoce el rol de NFkB. Se estudió el efecto de una disminución en los niveles de NFkB sobre la apoptosis inducida por TNF-a (2-100 ng/ml) en las células L-929 por: a) tratamiento con el inhibidor de la activación de NFkB, PDTC (1, 10,100 µM) y b) por transfección con un vector de expresión de IkB (mutante super-represor). PDTC 10-100 µM resultó en un 100 % de citotoxicidad en ausencia ó en presencia de TNF-a. Una dosis 1 µM de PDTC al igual que la expresión del super-represor IkB, tuvo un efecto significativamente inhibitorio de la apoptosis inducida por TNF-a (18 ± 3 y 23 ± 5 % menor que TNF-a 2 ng/ml, respectivamente). Se determinó además el efecto de dexametasona (Dex) 20 nM sobre la inducción de mRNA de IkB, en presencia ó en ausencia de TNF-a (2 ng/ml, 2 hs). Se observó una inducción de IkB en respuesta a TNF-a, Dex sola no tuvo efecto, pero en presencia de TNF-» produjo una disminución en los niveles del factor inhibidor. Estos resultados demuestran que en este modelo, NFkB tendría un rol protector en la apoptosis inducida por TNF-a y los GC ejercerían su acción antiapoptótica por un mecanismo que no involucra la disminución en los niveles de NFkB vía la inducción de IkB.

135. Expresión y función de receptores de citoquinas de la familia de IL-6/gp 130 en la hipófisis. Carolina Perez Castro1, Alberto Carbia1, Florian Kuchenbauer2, Marcelo Paez Pereda2, Ulrich Renner2, Günter Stalla2, Eduardo Arzt.1,3.
1Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA, 2Max Planck Institute, Munich, Alemania

Las citoquinas actúan como reguladores auto/paracrinos de la hipófisis a nivel de la secreción hormonal y la proliferación. En este contexto estudiamos el rol de la familia de citoquinas gp130 en la hipófisis, en particular el ciliary neurotrophic factor (CNTF) y la interleuquina-11 (IL-11). Encontramos que las células lacto/somatotrofas GH3, poseen el receptor de CNTF (Northern Blot, 2 kb) y que el CNTF regula la secreción hormonal (RIA): 24 hs post-estimulación, basal vs CNTF 30 ng/ml: GH ng/ml: 1027.4 ± 29.1 vs. 1230.0 ± 42.6; p< 0.001 y PRL ng/ml: 502.6 ± 45.52 vs. 728.37 ± 71.03; p< 0.05. Contrariamente estas células, no expresan el receptor de IL-11, el cual está presente en las células no productoras de hormona, folliculo-estrellada (TtT/ GF) (Northern Blot, 1.8-2 kb). La IL-11 estimula la proliferación (ELISA para actividad de deshidrogenasas mitocondriales) de TtT/GF (24 hs post-estimulación-basal vs. IL-11 200 U/ml: 190%, p<0.001) e induce la secresión del vascular endothelial growth factor (VEGF) (24 hs post-estimulación-basal vs. IL-11 200 U/ml; VEGF (pg /ml): 88.49 ± 2.3 vs. 288.28 ± 23.9; p<0.05). La IL-11 podría entonces mediar efectos paracrinos entre estas células y las células productoras de hormona. Reportamos por primera vez la presencia de receptores de dos miembros de la familia de citoquinas gp 130: CNTF-R e IL-11-R, que ejercen funciones regulatorias en distintos tipos celulares de la hipófisis

136. Regulación de la apoptosis durante el desarrollo folicular. Fernanda Parborell, Marta Tesone.
Instituto de Biología y Medicina Experimental; Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto in vitro de un análogo de GnRH (LA) en folículos antrales tempranos (FT) y preovulatorios (FP) (ratas prepúberes tratadas con DES o eCG). Los folículos se incubaron en medio libre de suero en presencia de distintos estímulos y la apoptosis se determinó por extracción de DNA y corrida en geles de agarosa. En folículos antrales tempranos, LA (100 ng/ml) aumentó (30%) la apoptosis espontánea observada luego de 24 hs de cultivo, en cambio, la presencia de FSH (20-200ng/ml) o dAMPc (1mM) la disminuyó (75-85%). En ambos casos, el agregado de LA revirtió este efecto. Agregando factores de crecimiento al medio de cultivo, se observándo que EGF, FGF e IGF-1 rescatan parcialmente a folículos antrales tempranos de la apoptosis (% de inhibición: 70, 35, 70 respectivamente), y la presencia de LA impide este efecto. En folículos preovulatorios sólo el EGF resultó inhibitorio (96%) de la apoptosis espontánea y el LA revierte este efecto. Asimismo, el LA per se aumenta el % de fragmentación del DNA (650%). En ningún caso LA (100 ng/ml) modifica la producción de progesterona (FT: C =42.5±1.8, LA =46.31±0.81; FP: C=23.22± 3.5, LA=23.75±5.4). Se concluye que el LA ejerce un efecto sobre el ovario estimulando la apoptosis folicular, ya sea en forma directa o interfiriendo la acción de FSH o factores de crecimiento.