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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES EN POSTERS
INMUNOLOGIA BASICA Y
CLINICA 297. Unión de C3 con la forma fibrilar del amiloide b (A b).
Ester Saball, Marcela Salvarrey En estudios previos demostramos que la forma soluble de un péptido sintético de secuencia análoga al amiloide b del Alzheimer (Ab 1-40), se une con C3 con una Kd=7,5 ± 0.8 nM. Con el objeto de caracterizar la interacción de C3 con la forma fibrilar se agregó el péptido por incubación a 37°C una semana en PBS, inmovilizándolo sobre papel de nitrocelulosa y tiras de poliestireno que se incubaron con C3. En todos los casos el revelado se realizó con los monoclonales 6E10 (a-Ab1-16) y 4G8 (a-Ab17-24), y/o streptavidina-peroxidasa ó a-C3- peroxidasa. Por inmunoblotting se estudió la especificidad de la unión; por ELISA: a) se estimó la Kd ofreciendo cantidades crecientes de C3 y b) se estudió la naturaleza de la unión disociando la misma con 1M urea-1.5M NaCl e Hidroxilamina 1M pH=10. Los resultados experimentales indican que C3 se une específicamente a la forma agregada de Ab 1-40 con una unión covalente hidroxilamino sensible y una Kd de 780±120 nM. Esto constituye una evidencia de que la forma fibrilar de Ab podría iniciar la activación por la vía alternativa del Sistema de Complemento a través del ataque nucleofílico del C3.
298. El losartán, antagonista selectivo de los receptores AT1
para angiotensina II, inhibe el reclutamiento de neutrófilos en
pulmón en respuesta al FMLP. Silvina Raiden, V. Nahmod, Yanina
Pereira, Corina Gustavson, Clarisa Alvarez, J Geffner Previamente mostramos que el losartán inhibe, in vitro, la unión del FMLP a su receptor en el neutrófilo. Aquí examinamos su capacidad de inhibir el reclutamiento de neutrófilos en pulmón inducido por instilación intratraqueal (it) de FMLP (10-6 M), en ratas wistar tratadas o no con losartán, por infusión endovenosa. Se observó una disminución en el contenido de mieloperoxidasa (MPO) en pulmón (D Abs a 492 nM), por tratamiento con losartán: FMLP 1138±185, n=12 vs FMLP+losartán 20 y 4 µg/kg/min, 792±68 y 769±149, n=6, p<0.01. Otros antagonistas del sistema renina angiotensina: saralasina (10 µg/kg/min) y captopril (200 µg/kg/min) fueron inefectivos: D Abs=1139±85 y 1116±15, n=3. Empleando Pseudomona aeruginosa por it encontramos también que el losartán 20 µg/kg/min previno el reclutamiento de neutrófilos: D Abs 2086±90 vs. 1013±129, controles vs tratados, n=3, p<0.05. Se sugiere que el losartán podría modular la respuesta inflamatoria aguda inducida por péptidos formilados bacterianos.
299. Efecto inhibitorio del benznidazol (BZL) sobre la
producción de óxido nítrico (NO) en macrófagos estimulados con
lipopolisacáridos (LPS) y/o interferón gamma (IFN-g). E Piaggio, C
Le Page, J Wietzerbin, O Bottasso, S Revelli Estudios preliminares para evaluar si el BZL actúa sobre la funcionalidad de células hospederas del T.cruzi indican que esta droga reduce la producción de NO en macrófagos tratados con LPS. Dado que la síntesis de NO en macrófagos está controlada por la NO sintetasa inducible (iNOS) se estudió el efecto del BZL sobre la expresión del gen de la iNOS y la síntesis de NO. Se utilizaron macrófagos murinos (RAW 264.7) estimulados o no con LPS (100 ng/pozo), y/o IFN-g (500 UI/pozo), tratados con BZL (en 2-metoxietanol) 0.1 mM, 0.5 mM, o 1mM/pozo. Los valores de NO2- (media ± es, µM) en sobrenadante de 24 hs de cultivo fueron LPS 28.4±0.6, LPS+BZL (1mM) 3.7±0.7; LPS+IFN-g 53±1.6, LPS+IFN-g+BZL 18.4±0.5; IFN-g 19.4 ±2.4, IFN-g +BZL 4.5± 0.5 (p<0.001). En cultivos paralelos de 6 hs, las células se lisaron en TRIZOL, y se extrajo el ARN total. El aislamiento del ARN no degradado se verificó por electroforesis en minigeles y el ARNm específico se detectó por Northern-blot. Se hibridizó con una sonda de ADNc [32P] para el gen de la iNOS, se expuso a un analizador de imágenes y se visualizó por autoradiografía. El ARNm iNOS no se halló constitutivamente expresado en las células no estimuladas o tratadas con BZL. En aquellas estimuladas la inducción de la iNOS fue máxima en los cultivos con LPS+IFN-g. El BZL causó una profunda reducción en la expresión del ARNm para la iNOS. El efecto inhibitorio del BZL sobre la síntesis de NO2- se debería a una acción sobre la iNOS.
300. Variaciones fenotípicas y funcionales de la inmunidad
innata en un modelo experimental de candidiasis y estrés. Cecilia
Rodríguez, S Correa, P Iribarren, C Sotomayor La candidiasis es una infección provocada por un hongo oportunista que precede a desequilibrios en el sistema inmune. Para el desarrollo de nuestro modelo experimental y a fin de evaluar las modificaciones que ocurren durante el curso de esta infección asociada al estrés trabajamos con cuatro grupos de animales: Normales (N); Infectados(Ca)(3x108 lev/ml); Estresados (E)(sometidos a un esquema de estrés crónico variado durante 10 días); e Infectados y Estresados (CaE). El estrés recibido se evaluó mediante el nivel de glucocorticoides, variación del peso corporal y del peso de órganos como timo, bazo y riñón. La colonización del hongo evaluada por UFC fue mayor en el grupo CaE. Se detectaron cambios significativos en la células reclutadas a la cavidad peritoneal en el día 3 para el grupo Ca y en el día 10 se observaron cambios notables en Ca y CaE respecto al grupo E(p<0.001).El estudio de estas poblaciones se completó con el análisis morfológico, fenotípico y funcional. Considerando ¨light scater¨parametros (FW vs SS) se observaron alteraciones en los grupos Ca y CaE, sugiriendo distinto grado de activación. El monitoreo por FACS de marcadores como IA, ICAM y OX42 evidenciaron una modulación de la expresión asociado a la presencia de la levadura. El análisis de la capacidad fagocítica evaluada por FACS reveló una disminución del porcentaje de levaduras engolfadas en los grupos Ca y CaE (18 y 14%) respecto de los animales N (34,5%). La producción basal de ON por Mf de los grupos infectados estuvo incrementada respecto de los grupos N y E(p<0.001), efecto que fue manifiesto luego de la activación de los Mf con LPS. Estos resultados muestran que el estres modifica parámetros claves involucrados en la progresión de la infección.
301. Respuesta neuro-inmuno-endócrina anormal en ratones
knock-out para b-endorfina. D Refojo1, D Kovalovsky1, J Young2, M
Rubinstein2, M Low3, JMHM Reul4, F Holsboer4, E Arzt1,4. Las relaciones existentes entre la b-endorfina y el sistema inmune han sido tan estudiadas como controversiales los resultados obtenidos. Estudiamos la proliferación de esplenocitos en cultivo y la respuesta adrenal en ratones C57BL/6 knock-out (KO) para la secuencia codificante de b-endorfina comparativamente con animales normales congénicos (Wild Type-WT). Los esplenocitos fueron estimulados con mitógenos selectivos para células B (LPS), células T (Con A) y células B-T (PWM) y su tasa de proliferacion fue medida por incorporacion de timidina tritiada. La respuesta mitogénica de animales KO (media ± SEM, cpm) Con A:43805 ± 2505, LPS: 16233 ± 4298, PWN: 24925 ± 125, fue significativamente (al menos p<0.05) mayor que en los WT: Con A:26150 ± 5350; LPS: 4650 ± 1150; PWN:13512 ± 955. La respuesta de corticosterona a la administracion periférica de LPS (250 µg/ml, i.p) muestra que el pico del corticoide en los animales KO (media ± SEM, ng/ml): 35 ± 13.3 es menor que en los WT: 642 ± 122 (p<0.01).La ausencia de b-endorfina en estos ratones genera una mayor actividad mitogénica y concordantemente una respuesta del eje protector adrenal significativamente disminuida, lo cual facilitaría la respuesta antigénica. Podemos concluir que la b-endorfina cumpliría globalmente un papel inhibitorio en el desencadenamiento de la respuesta inmune.
302. El factor estimulante de colonias
granulocítico-macrofá-gico modula la apoptosis de células
dendríticas (CD) inducida por diclorometilen difosfonato asociado a
liposo-mas (L-DMP). GA Rabinovich, Clelia M Riera, P Iribarren El L-MDP elimina células macrofágicas por inducción selectiva de apoptosis. En el presente estudio se evaluó el efecto potencial de L-MDP sobre el umbral apoptótico de CD purificadas de bazo de ratas Wistar y cultivadas en ausencia o en presencia de L-MDP (25 mg/ml) durante 4 a 6 h. El L-MDP indujo fragmentación del DNA genómico en bandas oligonucleosomales de ~180-200 pb y la morfología ultraestructural típica de células apoptóticas. El ensayo de TUNEL adaptado para citometría de flujo reveló 49% de incorporación de deoxinucleótidos biotinilados con respecto a células cultivadas en ausencia de L-DMP (13%). Como el GM-CSF promueve la expansión y maduración de CD se cultivaron estas células con dicha citoquina durante 18 h. Las CD fueron luego tratadas con L-MDP por 4 o 6 h, observándose una reducción del patrón de fragmentación del DNA, y de los niveles de células TUNEL positivas en las células tratadas con GM-CSF. Este efecto protector correlacionó con una inducción de la expresión de Bcl-2 evaluada a través de ensayos de Western blot. La regulación del umbral apoptótico de CD permitiria estudiar e intervenir clínicamente procesos inmunológicos en los cuales estas células juegan un rol esencial.
303. Células dendríticas: maduración y adhesión a endotelio.
CC Jancic, VP Lutzky, L Fainboim, HE Chuluyan Las células dendríticas (DC) son las más eficientes células presentadoras de antígenos y juegan un papel crítico en la inducción de la respuesta inmune. Existen evidencias de que el TNFa puede modular la capacidad de adhesión de DC modificando su estado de maduración. En estudios previos mostramos que las DC derivadas de monocitos son capaces de interactuar con células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC). El objetivo del presente trabajo fue estudiar las moléculas involucradas en la adhesión de DC a endotelio. Los monocitos de sangre periférica diferenciados a DC con IL-4 y GM-CSF durante 7 días mostraron una adhesión a HUVEC no activado del 45+2% (p<0.05, n=3). Esta adhesión fue parcialmente inhibida con mAbs contra CD29 y CD18. Las DC tratadas con TNFa presentaron mayor expresión de CD18, en tanto que CD29 no se modificó. Sin embargo, este aumento en la expresión de CD18 no se ve reflejado en un aumento en la adhesión. Por el contrario, DC tratadas con TNFa mostraron menor adhesión a HUVEC no activado (37+2%; p<0.05, n=3). Estos resultados sugieren que las DC presentan distinto grado de adhesión dependiendo del estado de maduración, siendo las más maduras menos adherentes a endotelio no activado. Además, la adhesión de DC inmaduras es parcialmente dependiente de CD18 y CD29.
304. El sistema mononuclear fagocítico regula la toxicidad por
verocitotoxinas en un modelo murino de sindrome urémico hemolítico.
M Palermo, F Alves Rosa, M Beigier, N van Rooijen, MA Isturiz. El sindrome urémico hemolítico (SUH) es una enfermedad asociada a infecciones por bacterias gram negativas productoras de verocitotoxinas (VT) y es la primera causa de disfunción renal en la infancia. El objetivo de este trabajo fue estudiar la participación del sistema mononuclear fagocítico (SMF) en la acción tóxica de la VT tipo 2 (VT2) y de factores coadyuvantes como los lipopolisacáridos (LPS) en un modelo murino. El SMF se inactivó por inyección i.v. de diclorometilendifosfonato encapsulado en liposomas (Cl2MDP) e inhibe funciones del SMF como el “clearance” de complejos inmunes. Doce ratones BALB/c por grupo fueron inyectados con a)VT2, b)VT2+LPS, c)VT2+Cl2MDP, d)VT2+ LPS+Cl2MDP. La sobrevida en los grupos fue la siguiente: a) 25% ,b) 8% ,c) 67% ,d) 58%.Los grupos c) y d) son significativamente diferentes de a) y b), p<0.001. La acción del Cl2MDP se manifiesta sólo si se inocula 72, 48 ó 24 h previo a la VT2, pero no con la inoculación simultánea o posterior. Por otra parte la toxicidad de la VT2, con o sin LPS, fue similar en ratones “nude” y BALB/c indicando la irrelevancia del compartimiento T en la acción de VT2. Los resultados obtenidos indican que el SMF juega un papel activo en la acción tóxica de la VT2 sola, o en presencia de LPS, probablemente por la menor secreción de citoquinas por hígado y bazo.
305. Generación de tolerancia a lipopolisacáridos bacterianos
(LPS) por citoquinas inflamatorias. M Vulcano, L Mari, M Beigier, M
Palermo, MA Isturiz La tolerancia a LPS es un mecanismo activo inducido por la inoculación de bajas concentraciones de LPS, que provoca una inhibición de la síntesis de determinadas citoquinas. La generación y/o ruptura de la tolerancia a LPS es un mecanismo fundamental en la fisiopatología del shock séptico, y en los múltiples mecanismos activados por LPS. El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia sobre la tolerancia a LPS de dos citoquinas de secreción temprana inducidas por los LPS: TNF-a e IL-1b. Grupos de 8 ratones BALB/c fueron inoculados con una dosis diaria, durante 3 días de: a) 0,1 µg de TNF-a , b) 0,1 µg de IL-1b, c) 0,1 µg de TNF-a + 0,1 µg de IL-1a, d) 2 µg de LPS, e) salina. En el cuarto día los animales fueron desafiados con una dosis letal de LPS (200 µg/ratón). La mortalidad fue la siguiente: a) 100%, b) 25%, c) 0%, d) 0%, e) 100%. Debido a la temprana muerte en a) comparada con b) y e) se analizó si el TNF-a podía desactivar los mecanismos de tolerancia. Para ello, animales tolerantes a LPS y sensibilizados a la acción del TNF-a con 18 µg de D-galactosamina fueron desafiados con 0,1 ug de TNF-a. Los animales tolerantes sobrevivieron y en los controles la mortalidad fue de 100%. Se demuestra que dos citoquinas, de efectos antagónicos sobre la tolerancia a LPS, actúan sinégicamente en la inducción de los mecanismos de tolerancia.
306. Efecto proliferativo del factor de crecimiento semejante a
la insulina tipo-1 (IGF-1) sobre linfocitos T (LT) a través de la
síntesis de IL-2 y de la cadena a de su receptor (CD25). Verónica
White *, Adriana Galeano#, Mariana Brocardo*, Roxana Schillaci*. Hemos demostrado que la activación de LT produce una disminución en el receptor de IGF-1 previa a la síntesis de la IL-2 y a la expresión del CD25. En el presente trabajo se estudió el efecto del IGF-1 sobre la producción de IL-2 y la expresión de CD25 en LT lo largo de la estimulación. Para ello LT humanos se purificaron por roseteo y se cultivaron en medio sin suero con 2 µg/ml PHA, determinándose la concentración de IL-2 por ELISA, la expresión de CD25 por citofluorometría y la proliferación por incorporación de timidina-3H (TdR). El porcentaje de células CD25+ resultó: 0h 11.94±1.65, 6h 13.28±1.92, 12 h 58±7.99, 20 h 85.5±3.85. El IGF-1 incrementó un 24±4% a las 12 hs, observándose a las 20 hs diferencia en la intensidad de fluorescencia (+28±8%, P<0.05). La producción de IL-2 a las 6 h osciló entre 7.1±0.9 y 96.1±9.9 pg/ml y a las 12 h entre 33.5±3.6 y 532.3±0.6 pg/ml. La presencia de IGF-1 aumentó la producción a las 6 h un 107.7 ±10.3 % (P<0.001) y a las 12 h un 63.3±5.4 % (P<0.001); siendo, a las 48 hs, el incremento de TdR 124±4 %. Los resultados sugieren que el IGF-1 aumenta la síntesis temprana de IL-2 y del CD25, optimizando de esta manera la proliferación de los LT.
307. Efecto sinérgico de anticuerpos anti-CD24 en la
proli-feracion inducida por IL2 sobre células mononucleares
periféricas. C Rosselot, GB Reyes, GV Salamone, AK Mendiguren, L
Fainboim, M del C Salamone. El antígeno HSA de ratón (homológo al CD24 humano) se expresa transitoriamente en la membrana de linfocitos T (LT) activados y se encuentra involucrado en señales co-estimulatorias mediados por anticuerpos anti -CD3 + anti -CD28. La expresión en LT del antígeno CD24 humano, descripto inicialmente en linfocitos B y en granulocitos, presenta aún controversias. Previamente, hemos demostrado que esta molécula se expresa en la membrana de linfocitos T activados con una cinética particular que depende del epitope estudiado. En este trabajo evaluamos el efecto de los anticuerpos dirigidos contra el epitope proteico LAP (AcMo SWA11 y ML5) en la proliferación de células mononucleares periféricas (CMP) estimuladas: i) con anticuerpos anti CD3/CD28; ii) con IL2R. Los resultado obtenidos, de acuerdo al nivel de timidina 3H incorporada, permitieron establecer que esta molécula presenta, también en humanos, un efecto sinérgico sobre CMP activadas vía CD3/CD28 (x±SEM; AntiCD3/CD28:51.643±9949, AntiCD3/CD28/ SWA11: 75.240 ± 4317). Por otra parte, cuando se evaluó el efecto poducido por los anticuerpos sobre las CMP estimuladas con IL2R (20U/ml), los resultados demostraron un incremento estadísticamente significativo en la proliferación celular inducida por esta citoquina.(x± SEM; IL2+AcMo irrelev.: 5873±762; IL2+SWA11: 13146±2860, p<0,04; IL2+ML5: 13530±5032, p<0,01, N=7). Se concluye entonces que esta molécula está involucrada en señales co-estimulatorias en humanos actuando por un mecanismo que involucra IL2.
308. CD74 y CD85: antígenos involucrados en la proliferación
alogeneica. GB Reyes, C Rosselot, GV Salamone, AK Mendiguren, L
Fainboim, M del C Salamone Los antígenos CD74 y CD85 han sido descriptos inicialmente como moléculas expresadas en linfocitos B y células presentadoras de antígeno (CPA). Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que estos antígenos se expresan en la superficie de los linfocitos T (LT) activados y en el caso particular del antígeno CD85 en una pequeña subpoblación de linfocitos T circulantes (£15%). En el presente trabajo analizamos los efectos de los anticuerpos, dirigidos contra estas moléculas (anti CD85: AcMo VMP55 y GHI/75, anti CD74: LN2 y BU45) en la proliferación celular mediada por cultivo mixto linfocitario (CML). Los resultados obtenidos, evaluados por la incorporación de timidina3H, demostraron que los AcMo anti CD85 y anti el epitope C-terminal de la molécula CD74 (LN2) tienen la capacidad de bloquear parcialmente el CML [(i) para CD85, x± SEM; CN= 23848±2580, VMP55=1460±266,GHI/75=1350±221,p<0,01, N=12; (ii) para CD74, x±SEM; CN=30058±4311, LN2= 16906±2338, p<0,05, N=7]. Bloqueos unidireccionales permitieron establecer con el anticuerpo VMP55 que este comportamiento no se debe sólo al bloqueo de las moléculas CD85 expresadas en la superficie de las CPA, sino tambíen a aquellas presentes en los LT (x ± SEM; CN= 25006±4696, células respondedoras + VMP55=8814± 1893, p<0,05, N=6). La adición de anticuerpos anti-CD74 luego de 0, 24, 48 y 72 de activación permitieron inducir un comportamiento similar para esta molécula. Se puede concluir entonces que ambos antígenos se encuentran involucrados en la proliferación mediada por CML.
309. Detección de transcriptos del antígeno CD1 en células
mononucleares periféricas. María del C Salamone, Ga-briela V.
Salamone, Ana K Mendiguren, M Barboza, L Fainboim Los antígenos CD1 han sido descriptos inicialmente como moléculas expresadas en la membrana de linfocitos pre-T. Si bien ha sido reportada la detección del isotipo CD1c en linfocitos B maduros y del antígeno CD1a en células tímicas simples positivas CD4 y/o CD8 no se ha establecido la expresión de estas moléculas en linfocitos T periféricos en estado de reposo. En este trabajo nosotros estudiamos la expresión del antígeno CD1c en el citoplasma de linfocitos T circulantes. Los resultados obtenidos por RT-PCR sobre células mononucleares periféricas (CMP) de individuos normales, revelaron la presencia de transcriptos de esta molécula en 9/9 casos analizados. Purificación de poblaciones de linfocitos B, monocitos y células T (< 95% de pureza) permitieron establecer la presencia de estos transcriptos en las tres poblaciones celulares. La estimulación de CMP con PHA (3/3), indujo un brusco descenso en los niveles de transcriptos detectados luego de 18hr de cultivo, restableciéndose esta expresión posteriormente. Los resultados obtenidos por citometría de flujo de marcaciones citoplasmáticas de CMP en reposo, permitieron determinar la presencia de la molécula CD1c en el citoplasma celular, en niveles muy variables entre individuos. En el período comprendido entre las 5 y 21 hs de activación pudo detectarse una expresión transitoria de este antígeno en la membrana plasmática. Se puede concluir que transcriptos del antígeno CD1c se encuentran constitutivamente presentes en linfocitos T en reposo y que el comportamiento detectado en etapas tempranas de la activación, indicarían que esta molécula estaría involucrada en mecanismos que regulan la activación celular mediada por PHA.
310. Glucosilación de IgG in vivo durante una reacción de fase
aguda. Andrea Canellada, Ileana Malan Borel , Ricardo Margni Ha sido descripta una alteración en el patrón de glucosilación proteica durante una reacción de fase aguda. Aquí hemos evaluado el efecto de la respuesta inflamatoria producida por la administración (sc) de trementina, sobre la síntesis y glucosilación de IgG en rata, analizando sueros obtenidos a 24 h, 3 dias, 7 dias, y 15 días post inoculación. Trementina con y sin la administración 24 h antes de una dosis de dexametasona (vo), G4 y G1 respectivamente, disminuyó los niveles de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG2c, efecto que fue máximo a los 3 días post-inoculación para IgG2c e IgG2b. La sola administración de dexametasona (G3) no modificó los niveles de IgG. Las DO a 490 nm por ELISA a los 3 días fueron para IgG2b: control, 0.1860±0.120; G1, 0.0983±0.0099*; G3, 0.1700±0.0130; G4, 0.1007±0.014*. La glucosilación de IgG2a e IgG2b se determinó por fijación a ConA. Trementina incrementó el porcentaje de fijación de IgG a la lectina a 24 h y 3 días post inoculación. Los porcentajes para IgG2b 24 h: control, 30.30±2.44; G1, 64.90±5.00*. Dexametasone (G3) o previo a trementina (G4), no modificó el % respecto al control. Para concluir, durante una inflamación aguda se produjo una disminución de la síntesis de IgG que no fue afectada por la administración de dexametasona, mientras que si lo fue el incremento en la fijación de IgG a ConA observado al administrar trementina. Estos resultados sugieren un rol de la síntesis y glucosilación de IgG en la modulación de la respuesta inflamatoria.
311. Anticuerpos antiglóbulos rojos de carnero en Bufo arenarum
intoxicado con plomo. Carolina E Rosenberg1,2, MA Arrieta3, NE Fink3,
A Salibián1,4 Para evaluar el efecto del Pb sobre la inmunidad humoral se cuantificaron anticuerpos antiglóbulos rojos de carnero (AbGRC) en el sapo B. arenarum inyectados una vez por semana con 50 mg Pb.kg-1. Los animales (controles inyectados con acetato de Na, n=23; experimentales con acetato de Pb, n=18) fueron aclimatados 7 días a 20°C y fotoperíodo 12 D: 12N constante. Se obtuvo sangre por punción cardíaca a tiempo inicial y final (42 días). Los niveles de Pb en sangre entera (PbS, en mg/dl) se determinaron por EAA y los AbGRC séricos por ELISA. Los resultados se expresaron como x ± DS. En los sapos inyectados con el metal [PbS=8.2±2.2] hubo un aumento significativo (p<0,014) de los AbGRC (Abs 1/200=0.844±0.254) con respecto al inicio del experimento (0.624±0.257). En los controles [PbS=2.2±1.0] no se observaron diferencias significativas entre la Abs final (0.946±0.484) y la inicial (0.784±0.383). No se encontraron correlaciones significativas entre PbS y AbGRC. Se concluye que el Pb estimula la producción de anticuerpos naturales en el modelo experimental estudiado.
312. Estudio de la interacción del lactógeno placentario ovino
(oPL) con receptores para hormona de crecimiento humana (hGH). Silvia
Longhi, Carlota Wolfenstein-Todel, Karina Gómez, Marta Miranda, Lilia
Retegui El oPL es una proteína que pertenece a la familia de las GH y las prolactinas (PRL). A pesar de que su homología de secuencia con la PRL ovina y con las GH es baja, el oPL presenta tanto actividad lactogénica como somatogénica, característica que comparte sólo con la hGH. El oPL no fue reconocido por un panel de anticuerpos monoclonales (MAb) ni por sueros policlonales anti-hGH, lo cual indica que las topografías antigénicas del oPL y la hGH son muy diferentes. El oPL inhibió completamente la unión de la hGH a receptores lactogénicos de células Nb2 y a receptores somatogénicos de hígado de conejo, mientras que sólo se unió a una subpoblación de receptores lactogénicos de hígado de rata. Además, el ión Zn2+ afectó de manera similar la unión de ambas hormonas a receptores de células Nb2 y de hígado de conejo, aunque aumentó la unión de hGH e inhibió la del oPL a receptores de hígado de rata. Estos resultados, y los obtenidos con un MAb dirigido contra el receptor de hGH y PRL, sugieren que el oPL y la hGH se unen a diferentes sitios de los mismos receptores.
313. Caracterización de epitopes crípticos y conformacionales
del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). Verónica
J Marino*, Aída Sterin-Prync#, Alejandro Vidal#, Lilia A Retegui*,
Leonor P Roguin* El G-CSF es un factor de crecimiento hematopoyético que estimula la proliferación y diferenciación de células precursoras y maduras. Con el propósito de caracterizar su interacción con receptores, se utilizaron dos anticuerpos monoclonales (MAb) anti-G-CSF denominados 295 y 136. Los dos MAb reconocieron al G-CSF insolubilizado en placas de polivinilo. Sin embargo, sólo el MAb 295 reconoció a la proteína en solución e inhibió la unión del 125I- G-CSF a receptores de membranas de placenta humana. Para identificar la estructura del epitope delimitado por los MAb se realizaron digestiones proteolíticas del G-CSF con diferentes endoproteinasas. Los fragmentos peptídicos obtenidos fueron separados por SDS-PAGE, transferidos a membranas de PVDF e incubados con los MAb. La secuencia de aminoácidos de algunos de estos fragmentos se determinó por degradación de Edman. Los resultados indicaron que el MAb 295 reconoció un epitope conformacional probablemente involucrado en el dominio de unión a receptores y localizado en la secuencia 1-122 del G-CSF. Por otro lado, el MAb 136 reconocería un epitope críptico comprendido entre los aminoácidos 23-93 o 23-98 de la citoquina.
314. Actividad antiproliferativa de un péptido sintético del
interferón a (IFN a). Viviana C Blank, Clara Peña, Lilia A Retegui,
Leonor P Roguin Con el propósito de identificar el dominio del IFN involucrado en la unión a receptores, se sintetizó el péptido correspondiente a la secuencia 122-139 del IFN-a2b y se estudió su efecto sobre la interacción IFN:receptor. Puesto que el péptido es hidrofóbico y presenta una cisteína en su secuencia, se estudió la posible presencia de agregados moleculares y/o dipéptidos por electro-foresis en geles de poliacrilamida y cromatografía en Sephadex G-25. Los resultados demostraron que el porcentaje de especies de mayor peso molecular disminuyó significativamente cuando el péptido se disolvió en un medio disociante y en presencia de un agente reductor. Sólo cuando se ensayó en este medio, el péptido inhibió la unión de 125I-IFN-a2b a receptores de membranas de células WISH (amnios humano) y la proliferación de las mismas. Los resultados indican que la región 122-139 del IFNa2b estaría involucrada en el dominio de unión al receptor y en la expresión de la actividad antiproliferativa de la citoquina, y advierten sobre el empleo de condiciones experimentales adecuadas para determinar la actividad biológica de péptidos.
315. Efecto de sobrenadantes de cultivo placentarios murinos
(SP) sobre la síntesis de hsp70. S Miranda, T Gentile, S Vidueiro, R
Margni En trabajos previos hemos demostrado que SP murinos inducían in vitro un aumento en el número de moléculas asimé-tricamente glucosiladas. El objeto del presente trabajo es dilucidar si las moléculas hsp70, relacionadas a procesos de plegamiento y glucosilación de proteínas, están involucradas en este mecanismo. Para ello se han obtenido SP de la cruza AKRxAKR -hembras multíparas: 3-4 partos- (n=3), de máximo efecto glucosilante. Dichos SP fueron adicionados al 5% a cultivos de hibridomas 112B4 y 112D3(4x106/ml) productores de mAcs. anti-DNP simétricos y asimétricos y cultivados durante 72 hs. La actividad anti-DNP y la proporción de moléculas asimétricas en los sobrenadantes de cultivo fue analizada empleando la técnica de ELISA antes y después de adsorber las moléculas glucosiladas por cromatografía de afinidad con Sepharosa-ConA. Las células (109) fueron lisadas por sonicación. La presencia de hsp70 en el producto lítico obtenido fue investigada empleando la técnica de dot-blot utilizando mAc a-hsp72/73, un sistema avidina-biotina específico y revelado por quimioluminiscencia. Como control de inducción de hsp70 las células del hibridoma fueron sometidas a un estímulo térmico (42°C, 60min) y como control de revelado se empleó hsp70 comercial. Los resultados obtenidos mostraron que ambos hibridomas en ausencia de SP, no expresan hsp70, mientras que dos de los SP empleados, culitativamente evaluados, han logrado inducir su síntesis.
316. Infección por MMTV en ratones deficientes en integrina b7.
Paula Berguer, P Bekinschtein, Isabel Piazzon, Susan Ross. El virus del tumor mamario murino (MMTV) se transmite a través del amamantamiento. Se ha postulado que los linfocitos de las placas de Peyer (PP) serían su primer blanco. Se sabe que la mayoría de estos linfocitos expresan la integrina b7 que media la adhesión a las vénulas de endotelio alto (HEV) de las PP y su retención en las mismas. Para investigar el rol de dichos linfocitos en la infección por el MMTV, ratones knock-out (KO) para integrina b7 y hermanos controles que expresan dicha molécula, fueron infectados con MMTV C3H a través del amamantamiento. A los 6 meses se analizó la frecuencia de los clones T Vb14+ reactivos al superantígeno en sangre periférica mediante técnicas citofluorométricas. Los resultados se expresan como el promedio del porcentaje de células T Vb14+ CD4+ ± DS (n): 1) b7 controles: 2.57±0.82(4); 2) b7 KO: 1,76±0.65 (5); NS. Se estudió la integración del virus en timo, ganglios, PP y bazo mediante PCR semicuantitativo y posterior hibridización utilizando primers y sonda específicos para el LTR viral y se observó la presencia de provirus tanto en los ratones b7 KO como en los controles. No se encontró disminuida la integración viral en los ratones KO. El conjunto de estos resultados sugiere que la ausencia de linfocitos que expresan integrina b7 no impide la infección de los ratones por el MMTV C3H.
317. Evaluación de la funcionalidad de las diferentes clases de
RFcg murinos. Efecto del LPS. Modulación por el anti-CD11b/CD18. C
Rubel, GC Fernández, I Mathov, M Isturiz, M Palermo Anteriormente, demostramos que el tratamiento in vivo con LPS aumenta la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) mediada por el RFcg. Dicho aumento se ve bloqueado por la preincubación in vitro con anti-CD11b/CD18.Considerando que existen 2 tipos de receptores RFcg diferentes (RFcg I que une IgG3 y RFcg II/III que une IgG1) evaluamos si el aumento de la CCDA estaba restringido a algunos de los 2 receptores. Se observó que el LPS produce un aumento de la CCDA mediada por el RFcg II/III sólo a alta concentración de IgG1 (N=31.4±1.3 LPS=53.8±1.9 n=15 p<0.0001). En el caso del RFcg I el aumento fue mayor a baja concentración de IgG3 (N=22.1±1.5 LPS=37±2.9 n=11 p<0.0001). Posteriormente se analizó si el bloqueo por el anti-CD11b/CD18 inhibe la CCDA mediada por los dos tipos de receptores. Los resultados son: RFcgI (N+aCD11b/CD18=10.4±0.4 LPS+aCD11b/CD18= 7.8±1.2n=8p<0.0001),RFcgII/III(N+aCD11b/CD18=19.8±1.4LPS+aCD11b/CD18 = 19.4±1.1 n=12 p<0.0001). Los resultados muestran que el LPS aumenta la CCDA mediada por ambos tipos de receptores, mientras que el tratamiento in vitro con anti-CD11b/CD18 lleva los niveles citotóxicos a valores normales, sugiriendo que el CD11b/CD18 participa amplificando la CCDA tanto por el RFcg I como por el II/III murinos.
318. Mecanismos involucrados en la respuesta al superan-tígeno
codificado por los virus MMTV BALB14 y C3H. Valeria Buggiano,
Alejandra Goldman, P Bekinschtein, Paula Berguer, Irene Nepomnachy,
Isabel Piazzon. En este trabajo se compara la capacidad estimulatoria del superantígeno (SAg) codificado por el MMTV exógeno BALB14 (reactivo a los clones T Vß14+) con otro conocido, el C3H, cuyo SAg, débilmente estimulatorio, posee la misma especificidad. Leche portadora de a)BALB14, b)MMTVC3H o c)libre de virus fue inoculada en la almohadilla plantar y al día 4 se determinó por citofluorometría el N°absoluto de linfocitos 1)T Vß14+ (reactivos a ambos SAgs) y 2)B IgG+ en el ganglio poplíteo (gp). En todos los ensayos se evaluó la frecuencia de clones T no relacionados. Los resultados fueron: 1)a)2.1±0.6(4) vs b)1.2±0.3(4)* vs c)0.2±0.01(4); 2)a)4.7±1.3(4) vs b)5±0.8(4) vs c)1.4±0.4(4) (media±DS(x10-6)(n)). Se investigaron los mecanismos involu-crados en la actividad estimulatoria. El N° absoluto de linfocitos en fase S y G2-M, usando ioduro de propidio y acs. mono-clonales fue:1)a)23±3(4) vs b)8±0.9(4)* vs c)0.4±0.04(4); 2)a)24±3(4) vs b)15±3(4) vs c)1.8±0.8(4) (x10-4)(n). Se inocularon por via iv linfocitos marcados con FITC simultáneamente a la estimulación con los virus. El Nº de linfocitos FITC+ en el gp fue: 1)a)90±6(4) vs b)40±5(4)* vs c)10±2(4); 2) a) 39±3 vs b) 65±7.2 vs c) 17±1.4 (x10-3)(n). Esto demuestra que la mayor capacidad estimulatoria detectada para el SAg del BALB14 respecto del de C3H correlaciona con una diferencia significativa (*p<0.05) en la proliferación como en el reclutamiento de los clones T reactivos. Si bien ambos virus inducen un aumento similar en el número de células B IgG+, los mecanismos involucrados son diferentes.
319. Marcadores serológicos de respuesta inmune. P Paradiso, O
Vargas, L Adan Una donación de sangre sólo es apta para ser transfundida cuando las pruebas serológicas resultan no reactivas para HBV, HCV, HIV, HTLV, Enfermedad de Chagas, Sífilis y Brucelosis. Sin embargo y dado el período de ventana inmunológica, es posible estar en presencia de un individuo recientemente infectado. Objetivos: 1) Cuantificar IL-6, IL-4 e IFNg .Establecer el rango de cc normal de IL-6 en muestras no reactivas. 3) Detectar PCR (Proteína C Reactiva) y correlacionarla con IL-6. Materiales y Métodos: Muestras de suero provenientes de 150 donantes: 70%Hom.-30%Muj.-edad: 26-58 años, se desarrolló serología convencional y se determinó la cc de IL-4, IL-6 e IFNg. Resultados: Donantes reactivos: 17/150 mostraron incremento de alguna de las interleuquinas investigadas, 2/17: IFNg (HIV, Ac Heterófilos), 2/17 IL-6 (Chagas-HBV), 7/17: IL-4 (HCV-HBV-HIV-Antígenos febriles), 5/17: PCR, IL-6 sin otra patología, 1/17: PCR, IL-6 (Salmonelosis). Donantes no reactivos : IL-4 e IFNg no detectables, la cc de IL-6 resultó 7.72±2.29 pg/ml. Conclusiones: Las concentraciones de PCR e IL-6 se correlacionan (r=0.97). Proponemos la investigación de PCR, dado su bajo costo y la sencillez de la determinación.
320. Enfermedad de Chagas experimental: Modulación de los
niveles de IL12 e IL10 por inmunización de ratones con Trypanosoma
rangeli B Basso, E Moretti, L Cervetta, C Truyens, Y Carlier En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo de inmunización en ratones Balb/c con Trypanosoma rangeli, que protege de la infección con T. cruzi. El objetivo de este trabajo fue analizar el balance entre IL12 e IL10, citoquinas involucradas en la selección de la respuesta inmune hacia Th1 o Th2, en el suero de ratones normales (N), infectados con 1500 tripomastigotes de T. cruzi cepa Tulahuén (I), e inmunizados con epimastigotes fijados de T. rangeli previo a la infección (I-I). Los valores de IL12 en N, fueron de 979±124 pg/ml; en I el día 13pi: fueron 4020±403 pg/ml y los I-I revelaron una concentración de 9478±970 (p<0.003). Por el contrario, IL10 mostró en los N valores de 24.8±15 pg/ml, mientras que en I fueron para el mismo día, 198±99pg/ml (p<0.01).y los I-I niveles similares a los normales (27.7±99pg/mlL. Los resultados demuestran que la inmunización con T. rangeli induce un aumento significativo de IL12 y por el contrario, reduce la liberación de IL10 a niveles normales. La modulación de este balance entre las citoquinas estudiadas, podría ser uno de los mecanismos involucrados en la resistencia inducida por la inmunización con T. rangeli en este modelo experimental.
321. Expresión intracelular de citoquinas en sangre de cordón.
A Bernasconi, J Rossi, A Somardzic, M Panozzo, A Lopez, M Zelazko El uso de sangre de cordón como fuente de precursores hematopoyéticos, con características particulares de reconstitución inmunológica y menor incidencia de enfermedad injerto contra huésped post trasplante, dan importancia al estudio del patrón de citoquinas de sus células inmunocompetentes. Como control se midió en sangre entera de adultos normales, estimulada con PMA/Ionomicina en presencia de Brefeldina A, la cinética de producción de IL2, IL4 e IFNg durante 24 hs. en células T CD3+CD8-( CD4+) y CD3+CD8+. Se evaluó en 6 muestras de cordón el patrón de citoquinas a las 4 hs de estímulo. La cinética en los adultos mostró a las 4 hs. una mayor proporción de células CD3+CD8-productoras de IL2 y en menor grado, IFNg e IL4.El pico máximo se vió a las 10 hs. para IL2 (48%) e IFNg (26%) y a las 12 hs. para IL4 (11%) Las CD3+CD8+ fueron mayoritariamente productoras de IFNg(30%) y en mucho menor proporción de IL2(8%), con máximos a las 10 hs.En cordón, el porcentaje de CD3+CD8- productoras de IL2 (media25,8%) fue comparable a los normales y no se observaron células CD3+ productoras de IFNg ni IL4. Una proporción de células NK (media 13%) expresaron IFNg. El patrón de citoquinas en CD3+CD8- de cordón concuerda con el fenotipo naive mayoritario de estas células (datos de nuestro laboratorio), siendo las NK las principales productoras de IFNg.
322. Producción de IL-2, IL-4 y fenotipo linfocitario en
cultivos con Medio Condicionado de Placenta Humana (MCPH). Mirta
Koncurat, A Vivas, D Zubeldía, C Greco Citoquinas del tipo Th2 modulan la respuesta que posibilita la gestación, varias de las cuales son fabricadas por la placenta. En nuestro laboratorio producimos MCPH que contiene IL-4, por ello el objetivo de este trabajo fue cuantificar IL-2, IL-4 y estudiar el fenotipo linfocitario en cultivos estimulados con MCPH. Se cultivaron sin y con 10% de MCPH linfocitos de 9 mujeres nulíparas y 10 primigestas en 1er. trimestre de gestación. A los 5 días poscultivo se cuantificaron en los sobrenadantes IL-4 e IL-2 por ELISA y se determinó el fenotipo de la población celular respondedora por IFI. En las gestantes, la [IL-4] fue de 12,77 ± 3,89 pg/ml en cultivos con 10% de MCPH y se observó un aumento significativo (p<0,05) del porcentaje de células CD19+ 23,70 ± 9,79; sin modificaciones en los porcentajes de los linfocitos CD8+ y CD4+. En los cultivos de las nulíparas la [IL-4] fue significativamente mayor (p<0,001) con un aumento significativo de los porcentajes de linfocitos CD19+ 17,23 ± 3,16 sin modificaciones en las subpoblaciones T. No se detectó IL-2. El aumento de linfocitos CD19+, la producción de IL-4 y la ausencia de IL-2 en los cultivos, demostrarían el efecto inmunomodulador del MCPH sobre el balance Th1/Th2.
323. Niveles séricos de il4, il10, inf-g y tgf-ß en pacientes
con ulcera gástrica y/o duodenal infectados con Helico-bacter pylori
(H. pylori). D Dlugovitzky, J Rainoldi, M Nogueras, G Fiorenza, M
Bravo-Luna, F Rainoldi Objetivo. Evaluar citocinas séricas, inmunomoduladoras, en infectados con H. pylori, importante agente etiológico en úlcera gástrica y/o duodenal. Metodología. 40 pacientes, ambos sexos (18-80 años). Diagnóst. endoscópico. Test de ureasa en tejido antral gástrico; anatomopatol., cultivo en medios p/H. pylori. Tests inmunológicos: Niveles séricos, pre y post tratamiento (Tto(IL4, IL10, INF-g, TGF-ß; ELISA, R&D Systems). Terapia combinada: omeprazol, amoxicilina, eritromicina. Control clínico y laborat.: a los 60 días. Estadíst.: Wilcoxon, Mann-Whitney, Spearman. Resultados. Citocinas en pacientes H. pylori (+), n=25 y (-), n=15, pre y post Tto. H. pylori (+): difer. signif. entre citocinas pre y post Tto(mediana e IC, pre y post: IL4 124 (92-195) y 101 (73-128); IL10 21(16-26) y 14 (11-17); INF-g 70 (42-80) y 115 (86-141); TGF-ß 84 (82-91) y 78 (62-81) p<,01). H. pylori(-): difer. N.S. Citocinas pre-post en H. pylori (+) y (-): IL4 U=2,74; IL10 U=3,48; INF-g U=2,07; TGF-ß U=3,28 p<,001). Citocinas vs terapia exitosa: (rs=0,52; p<,04). Conclusiones. 1) Confirmación etiológica de H. pylori. 2)Valores de citocinas alterados en pac. H. pylor (+).. 3) Difer. signif. en niveles de citocinas entre H. pylori (+) y (-). 4) Citocinas en infectados con H. pylori sugerirían predominio de TH1.5) Confirmación clínico-inmunológ. del Tto.
324. IL-12, TNFa e IFNg (CKs tipo 1) amplifican la citotoxicidad
T inducida por hsp65 (Cx) generando citotoxicidad NK-like. S de la
Barrera, M Alemán, S Fink, M Finiasz, L Rutitzky, MH Fariña, G
Pizzariello, MC Sasiain La presencia de IL-12, TNFa e IFNg en las primeras horas de cultivo aumenta la Cx T en pacientes con lepra paucibacilar (PB, n=4) multibacilar (MB, n=8) y normales (N, n=8). Se valoró si las células NK y T gd regularían la Cx T por producir CKs tipo 1. Células efectoras (E):mononucleares totales (CM) o deplecionadas de NK (DNK) o T gd (Dgd) cultivadas con hsp65 y TNFa, IFNg e IL-12 (7 días). Células blanco (B): 51Cr-[macrófagos autólogos pulsados con hsp65 o células K562]. E y B se enfrentaron 4 hrs (E:B= 40:1) determinandose el % de Cx. Se observó un aumento de actividad NK (K562) en los tres grupos. La Cx T se redujo un 50% en ausencia de NK y T gd [N: Cx-CM= 42+3, Cx-Dgd o Cx-DNK=22+3 p<0.05, PB:Cx-CM = 60+6, Cx-Dgd =33+3 p<0.05, Cx-DNK=39+4 p<0.05; MB:Cx-CM=23+4, Cx-Dgd o DNK= 10+1 p<0.05]. Bloqueando E con anti-CD56 en etapa efectora se observó inducción de actividad NK-like en PB y N frente macrófagos. Las CKs tipo 1 amplicarían la Cx T en las etapas tempranas de activación T a través de células NK y Tgd en MB, PB y N y/o generando actividad NK-like en PB y N.
325. Niveles circulantes de IL-4, IL-10 y anticuerpos anti-hsp
de 60 y 70 kD en pacientes con tuberculosis pulmonar que reciben
inmunoterapia con Mycobacterium vaccae. D Dlugovitzky, L Rateni, C
Largacha, M Farroni, O Bottasso Dado que la inmunoterapia con M.vaccae mejora los síntomas de la tuberculosis y provoca un descenso en los niveles de factor de necrosis tumoral alfa, también quisimos analizar los valores séricos de IL-4, IL-10, y anticuerpos hacia hsp de 60 y 70 kD de M.bovis. Se estudiaron dos grupos de pacientes sin diferencias en edad, sexo, grado de afectación pulmonar y tratamiento antibacilar, que al comienzo del mismo (día 0) recibieron aleatoriamente M.vaccae inactivado 108 bacilos (n=13), o solución fisiológica (n=10), vía id. Los resultados de los ELISA fueron (media ± es), día 0: M.vaccae, IL-4 685±77 (pg/ml), IL-10 3800±302, anti-70 kD 0.59±0.05 (DO) anti-60 kD 0.30±0.03; Placebo IL-4 586±63, IL-10 3863±270, anti-70 kD 0.62±0.06, anti-60kD 0.23±0.04; Controles (n=12) IL-4 69±9, IL-10 35±6, anti-70 kD 0.25±0.02, anti-60kD 0.20±0.02. Día 30: M.vaccae, IL-4 342±36, IL-10 2292±187, anti-70 kD 0.31±0.03, anti-60kD 0.19±0.02; Placebo IL-4 495±58, IL-10 3663±286, anti-70 kD 0.53±0.06, anti-60kD 0.20±0.04. La administración de M.vaccae promueve un descenso más significativo en los niveles de IL-4, IL-10 y anticuerpos anti-hsp de 70kD.
326. Determinación de la frecuencia poblacional de delta-ccr5.
Larisa Cybulski, Ernesto Ilriovich, Patricia Motta, Alicia Sorrentino Introducción: CCR5 es un receptor de beta-quimoquinas y actúa como co-receptor para la entrada de cepas de HIV que tienen tropismo por macrofagos, Individuos que no se infectan con HIV tienen una deleción de 32 nucleotidos en el gen de CCR5. La presencia de este gen mutado en estado homocigota,protege de la infección por HIV. En su estado heterocigota disminuiria la entrada y replicacion en linfocitos T CD4. Objetivos: Determinar las frecuencia de este alelo mutado en nuestra población normal y una población HIV +. Relacionarlo con las frecuencias observadas en otras poblaciones. Métodos: Se Estudiaron 73 individuos normales y 20 pacientes HIV+. Se extrajeron muestras de sangre y se separo el ADN por Salting out. Se determino la presencia del alelo deletado a través de una PCR que amplifica un segmento que flanquea la zona deletada. Se analizo el producto de PCR en geles de agarosa:189 pb /157bp Resultados: La frecuencia del alelo mutado fue 2.7 % (2/73)para su forma homocigota y 20,5 % (15/73) para su forma heterocigota en poblacion normal. En HIV+ solo se encontró la forma heterocigota en 1/20 (5%) Conclusiones: La presencia de la forma heterocigota y homocigota del alelo mutado en normales fue similar a la observada en otras poblaciones, en la poblacion HIV+ no se observó la presencia de la forma homocigota.
327. Diagnóstico de neurobrucelosis por detección de
anti-cuerpos anti-proteínas de Brucella en LCR. PC Baldi, JC Wallach,
Graciela C Racaro, CA Fossati En 1996 se registró el primer caso de neurobrucelosis (NB) detectado en el Hospital Muñiz en los últimos 10 años, confirmado por aislamiento de B. suis en líquido cefalorraquídeo (LCR). El diagnóstico inmunológico de la NB se basa en la detección de anticuerpos anti-lipopolisacárido (LPS) en LCR, pero no se ha ensayado la detección de anticuerpos contra proteínas citosólicas de la bacteria. El LCR y el suero del caso de NB, y de 2 pacientes con brucelosis y síntomas centrales (cefaleas intensas) pero sin NB, fueron ensayados por ELISA frente a 2 antígenos de Brucella: LPS y un extracto de proteínas citosólicas libre de LPS (CP). Se ensayaron además 10 LCRs de pacientes sin infecciones neurológicas (casos de Alzheimer) y 10 LCRs de pacientes con otras meningitis bacterianas (S. aureus, S. pneumoniae, N. meningitidis, M. tuberculosis). En el LCR del paciente con NB se detectó IgG anti-CP (1:800) y anti-LPS (1:3200). En suero, se detectó tanto IgM (1:400 y 1: 100, respectivamente) como IgG (1:6400 y 1:3200). En el suero de los 2 pacientes con brucelosis sin NB se detectaron anticuerpos anti-LPS y anti-CP de ambos isotipos, pero no se detectaron estas reactividades en LCR. El ELISA anti-CP fue negativo frente a LCRs de pacientes con meningitis por otras bacterias. Estos resultados sugieren que la detección de anticuerpos anti-CP puede resultar útil para diferenciar la NB de la brucelosis no complicada que provoca síntomas en el sistema nervioso central.
328. Rol de los polimorfismos del CCR5 y CCR-2 en la pato-genia
de la infección por HIV-1 infantil. Andrea Mangano, J Kopka, M
Batalla, R Bologna*, L Sen El CCR5 y CCR2 han sido identificados como coreceptores para la entrada del HIV-1 macrófago-trópico. La presencia de los polimorfismos CCR5-D32 y CCR2-64I en los genes CCR5 y CCR2 respectivamente, se asocia con un retraso de 2 a 4 años en la progresión a SIDA en adultos infectados. Nuestro objetivo fue investigar la influencia de estos alelos en la progresión a SIDA infantil. Se estudiaron 299 niños HIV-1 infectados por transmisión vertical. A partir de lisados de CMT, los distintos alelos se identificaron por electroforesis en geles de agarosa, posterior a la amplificación por PCR y PCR-RFLP para el CCR5 y CCR2, respectivamente. Los resultados obtenidos correspondieron a los siguientes genotipos: CCR5/CCR5=274; CCR5/CCR5-D32=25; CCR2/CCR2=222; CCR2/CCR2-64I=71; CCR2-64I/CCR2-64I=6. El análisis de las curvas de Kaplan-Meier para tiempo libre de SIDA no mostró diferencias significativas entre los pacientes con los alelos mutados o salvajes para dichos genes (Log-rank Test CCR5 P=0.5944; CCR2 P=0.7385). Sin embargo, del total de pacientes analizados, 17 fallecieron al momento del estudio, de los cuales sólo 1 tenía un alelo mutado, el CCR2-64I, sugiriendo una posible influencia del CCR2-64I y CCR5-D32 en la prolongación de la sobrevida de los pacientes infectados con el HIV-1.
329. Comparación de la Carga Viral (CV) durante la
primoinfec-ción por HIV en niños y su relación con protocolo 076 y
estadío clínico. Marcelo Batalla, A Mangano, J Kopka, R Bologna*, L
Sen El objetivo fue evaluar la CV en niños HIV+ sin tratamiento durante el año y medio de vida; compararlos con los estadíos clínicos y con los que recibieron o no profilaxis con AZT. Se realizaron 56 determinaciones de CV de 48 niños HIV+, divididos en 5 grupos etarios: I:0-3m (n:4), II: 3-6m (n:20), III:6-9m (n:15), IV: 9-12m (n:10) y V>12m (n:7). De ellos, 24 (Gx) no realizaron protocolo 076 y 12 (Gy) lo recibieron. De acuerdo al estadío clínico (CDC1994) se los clasifico en A (n:11), B(n:18) y C (n:19). La CV se realizó por RT-PCR Roche o NASBA Organon. Resultados: las medianas de las CV (x 106copias/ml) fueron: I: 1.57, II: 1.16, III: 0.74, IV: 1.08 y V: 0.43. Para los Gx: 1.42 y Gy: 0.59. Según el estadío clínico para los A: 0.46, B: 1.22 y C: 1.40. Conclusión: 1- el pico mayor de la CV se registró en el primer trimestre de vida, con un descenso paulatino más acentuado después del año; 2- aunque la CV en niños menores de 9 meses que recibieron 076 fue menor que los que no lo recibieron, no fue estadísticamente significativa, 3- la CV en niños asintomáticos A, fue significativa-mente más baja que los sintomáticos B y C (p<0.05).
330. Distribución del polimorfismo del SDF-1 y su incidencia en
la transmisión vertical del HIV-1. Julieta Kopka, M Batalla, A
Mangano, L Sen El factor derivado del estroma, SDF-1, es una quimioquina que es el ligando natural del correceptor para las cepas de HIV-1 T-trópicas, el CXCR-4. Recientemente, se describió una mutación que es una sustitución de G por A en la región 3’UTR del transcripto b del SDF-1 (SDF-1 3’A). Nuestro objetivo fue investigar la presencia de esta mutación en una población pediátrica expuesta al HIV-1 (239 infectados y 140 no infectados), y su posible rol en la transmisión vertical de la infección por HIV-1. A partir de lisados de CMT se amplificó por PCR un fragmento de la región 3’UTR del SDF-1 b y luego se digirió con MspI. Los fragmentos se identificaron en geles de agarosa. Los genotipos observados fueron: 66.9% SDF-1 +/+, 29.7% SDF-1 +/3’A y 3.3% SDF-1 3’A/3’A en infectados; y 65.7% SDF-1 +/+, 27.9% SDF-1 +/3’A y 6.4% SDF-1 3’A/3’A en no infectados. Las poblaciones se encuentran en equilibrio según Hardy-Weinberg. Nuestros resultados demuestran la presencia de esta mutación en la población estudiada. Si bien no se observaron diferencias significativas (p=0.369) entre la población infectada y no infectada, existe una tendencia a un mayor porcentaje de homocigotas mutados en la población no infectada. En conclusión esta mutación no afectaría la transmisión vertical por el HIV-1.
331. Las células NK y T gd modulan la citotoxicidad T a la
proteína hsp65 del M.leprae (Cx). M Alemán, S de la Barrera, M
Finiasz, S Fink, L Rutitzky, MH Fariña, G Pizzariello, MC Sasiain El objetivo de este trabajo fue determinar si las células NK y T gd, productoras tempranas de IFNg, modulan la Cx en pacientes con lepra e individuos normales (N). Células efectoras (E): se cultivaron células mononucleares totales (CM) o deplecionadas de NK (DNK) o T gd (Dgd) con hsp65 (7 días). Células blanco (B): macrófagos autólogos pulsados con hsp65 o células K562, marcados con 51-Cr. E y B se enfrentaron 4 hrs (E:B=40:1) y se determinó el % de Cx. Se observó en MB, una disminución de la respuesta citotóxica NK en CM frescas y cultivadas con aumento de la expresión de células CD56+ /CD16+ en CM frescas y valores de Tgd similares a PB y N. La depleción de NK o Tgd produjo una inhibión de Cx T en N (n=7) (Cx-CM=22+1, Cx-Dgd=12+2 p<0.05, Cx-DNK=10+1 p<0.05) y en los pacientes paucibacilares (PB) (n=4): (Cx-CM=22+1 , Cx-Dgd= 15+3, p<0.01, Cx-DNK=15+3, p<0.01). En los pacientes multibacilares (MB, n=10) no se observó modulación de respuesta citotóxica (Cx-CM=10+1, Cx-Dgd=10+2, Cx-DNK=9+2). Los resultados sugieren que la presencia de NK y Tgdregularía la actividad T citotóxica por producir citoquinas tipo 1 tempranamente.
332. Sensibilidad in vitro a Aciclovir de aislados clínicos de
Varicela o Herpes Simplex I. Síntesis de Igs y sCD23 AM Maldonado, FS
Ceriatti, VA Toranzo, LI Sabini En estudio previo se comprobó que niños inmunocompetentes alérgicos con Varicela (VZV) o Herpes Simplex I (HVS) tratados con Aciclovir mostraron menor diseminación de lesiones y mayor expresión de moléculas CD2. Los objetivos de esta instancia fueron determinar in vitro la sensibilidad de aislados clínicos al antiviral y evaluar in vivo los niveles de Igs y sCD23. Se investigaron 4 aislados clínicos VZV y 6 HVS. Aislamiento y stock viral se realizaron en monocapas de células Vero. Se utilizaron100 DICC50 con concentraciones variables del antiviral. Se evaluó el efecto citopático (ECP) por MO. Se estudiaron 26 alérgicos de 2-8 años, 13 con VZV y 13 con HVS. Se trataron 5d con Aciclovir 40mg/kg/d 6 de cada grupo y los demás con Placebo. Al inicio y 35d se determinaron niveles de IgG, IgA e IgM por IDR e IgE y sCD23 por EIA. EL ECP de VZV y HVS fue inhibido totalmente por 0.75 y 1.25mg/ml del antiviral. Correlacionaron IgE y sCD23, r=0.73. Los niveles iniciales de IgG, IgM e IgA fueron menores en HVS que VZV, p<0.02. IgG se elevó en HVS con Aciclovir p<0.02. Aciclovir in vitro inhibió el ECP a bajas dosis. In vivo regularía la síntesis de IgG y sería mas eficaz en HVS.
333. Los linfocitos B de ratones infectados con T. cruzi
presentan una gran activación celular y el estimulo con LPS modifica
su ciclo celular y la producción de IL-2. E Zúñiga, C Motrán, C
Montes y A Gruppi. El objetivo del presente trabajo fue investigar sobre linfocitos B (LiB) de ratones infectados con T. cruzi los eventos inmuno-bioquímicos que permitan explicar su hiporespuesta a LPS. Ratones normales fueron utilizados como controles. Observamos que LiB de animales infectados presentan apoptosis in vivo e in vitro (36 hs de cultivo) a juzgar por el mayor % de Li B220+ con DNA subdiploide (64% vs 31% de ratones normales). En los ratones infectados la población B220 low tiene mayor % de blastos que la población B220 high (30,3% y 18,1% respectivamente); y estos animales presentan un 28% de células B220 low vs un 14,5% en los ratones normales. Los ratones infectados tienen mayor % de células B220+Fas+ (39 vs 11% en los controles) y una mayor densidad de expresión de Fas en las B220+ (30,2 vs 18,1 en controles). Los LiB de ratones infectados son capaces de proliferar y secretar IgM e IL-2 espontáneamente y el estimulo con LPS disminuye su blastogénesis espontánea, produccion de IL-2 y el % de LiB 220+ que se encuentran en la fase S/G2/M del ciclo celular de 26,6% a 9,8%. Los resultados indican que LiB activados por la infección T. cruzi son conducidos a un fenotipo celular con mayor expresión de Fas y el estímulo con LPS produce un arresto de los LiB en G0/G1 y/o a una deleción de los que están en S/G2/M.
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