infecciones e inmunologia

Coordinador: Dr. CA Fossati

5. Detección de infección por HIV en cultivo primario de células mononucleares periféricas (CMP) de pacientes hemofílicos HIV+. Beatriz Ruibal-Ares, Liliana Belmonte, Graciela Méndez, Marta Felippo, Patricia Baré, María M.E. de Bracco.
Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Naiconal de Medicina, Buenos Aires.

El aislamiento del virus de la inmunodeficiencia adquirida (HIV) involucra generalmente estímulos exógenos que pueden favorecer la selección de las variables virales más adaptadas al sistema de cultivo, las cuales pueden no ser las de mayor relevancia en el paciente infectado. Recientemente hemos desarrollado un sistema de cultivo primario prolongado que favorece el contacto célula a célula y permite la diferenciación de monocitos/macrófagos (M/M) hasta alcanzar la formación de células gigantes multinucleadas (CGM). Utilizando esta técnica, detectamos la replicación de HIV (liberación de p24 al sobre-nadante, SN, por ELISA y carga viral por PCR) en 35/51 pacientes hemofílicos HIV+, estudiados repetidas veces a lo largo de cuatro años. En el 70% de los casos se detectó p24 en el SN entre los días 15-30 de cultivo. En pacientes que aún no habían desarrollado SIDA (Grupo B del CDC), o en asintomáticos infectados (Grupo A) las células positivas luego de 15 días de cultivo fueron de estirpe M/M y CGM. Fue posible observar M/M infectadas en pacientes con carga viral nula, despues de más de un año de tratamiento anti-retroviral combinado. En algunos pacientes, con SN p24+ (>150 pg/ml) desde el inicio del cultivo, también se detectaron linfocitos HIV+. En el 65% de los pacientes con SIDA (Grupo C3), los SN fueron débilmente positivos hasta el día 15, negativizándose a medida que el cultivo perdía viabilidad. En el 70% de los cultivos, especialmente en los pacientes de los grupos A2 y B2, a partir de los 40 días de cultivo, los linfocitos T y M/M eran reemplazados por células transformadas de estirpe B, y 50% de las líneas obtenidas eran HIV+. Los SN HIV+ resultaron infectivos para CMP normales cultivadas hasta 14 días con el mismo método, recuperándo altos títulos de HIV macrófago-trópico. Después de los 40 días, también se obtuvieron líneas celulares B transformadas a partir de CMP normales infectadas con SN HIV+. Este sistema, de ejecución simple, puede resultar ideal para el estudio de los factores que condicionan la multiplicación de HIV en un individuo dado, para evaluar la persistencia de infección después del tratamiento antiviral combinado y para analizar las causas de la génesis de proliferación B neoplásica en los pacientes infectados por HIV. Esto último es importante, porque uno de los objetivos en el tratamiento de la infección por HIV, es prevenir el desarrollo, tanto de las infecciones oportunistas, como el de los linfomas B de alto grado frecuentes en el SIDA, que resultan fatales por su refractariedad al tratamiento.

6. Factores genéticos celulares que pueden incidir en la evolución clínica de niños HIV-1 infectados por transmisión vertical. Luisa Sen, A. Magano, J. Kopka, N, Batalla, R. Bologna*.
Laboratorio Biología Celular y Retrovirus, y *Servicio de Infectología, Hospital de Pediatría J. P. Garrahan, Buenos Aires.

La célula CD4+ para poder ser infectada por el HIV-1 debe expresar siempre un correceptor que pueda ser empleado por el virus. Los virus R5 y X4 emplean los receptores para quimioquinas CCR5 y CXCR4, respectivamente. Si bien el HIV-1 R5 es el involucrado en la transmisión, diferentes variantes virales pueden surgir a lo largo de la infección con el empleo promiscuo de correceptores, siendo el más frecuente el CXCR4, generalmente asociado con una aceleración en el descenso de los linfocitos T CD4+ y en la progresión a SIDA. Estudios genéticos moleculares descubrieron una deleción de 32pb homocigota del gen CCR5 que impide la expresión del correceptor en la superficie celular, confiriendo una fuerte pero relativa resistencia a ser infectado por el HIV-1. En cambio, la heterocigosis del CCR5D32, aunque no impide la infección, es capaz de conferir un retraso en la progresión a SIDA. Otro determinante genético que podría estar asociado a una progresión lenta a SIDA es la presencia del alelo CCR2-64I. El CCR2 es considerado un correceptor poco empleado por el HIV-1, y el mecanismo por el cual puede ejercer la resistencia parcial aún no se conoce. El SDF-1 es el ligando natural para el CXCR4. Se ha postulado que la homocigosis para una mutación ubicada en la región no traducible 3’ del gen SDF-1, podría esta asociado a un retraso en la progresión a SIDA. Actualmente los 3 factores genéticos celulares que podrían condicionar un retraso en el desarrollo a SIDA, se basan en estudios realizados en adultos HIV-1 infectados y en la actualidad presentan una gran controversia. Nuestro objetivo fue estudiar en el SIDA infantil la influencia de los 3 factores genéticos celulares mencionados. Los resultados preliminares indican que la presencia de las variantes polimórficas del CCR5D32 y CCR2-64I en los niños HIV-1 infectados al ser comparados con los que poseen los genotipos salvajes para ambos correceptores, no modifican el tiempo libre de SIDA, pero pueden prolongar la sobrevida significativamente (p=0.013), Por el contrario, en los niños infectados la presencia del alelo mutado del gen SDF-1 (SDF-1 3’A) acelera significativamente el desarrollo a SIDA (p=0.0129) y acorta la sobrevida (p=0.033).

7. La utilización del interferon gamma (IFN-g) en la infección aguda experimental con Trypanosoma cruzi en ratas. S. Revelli, G. Dídoli, H. Dávila, E. Roggero, E. Piaggio, S. Feldman, O. Bottasso
Instituto de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Rosario.

El IFN-g es una citocina esencial para la resistencia hacia patógenos intracelulares. Como tal, nuestro laboratorio ha venido desarrollando una serie de estudios experimentales en ratas donde el IFN-g recombinante es administrado a razón de 20.000 UI/día tras el desafío con T.cruzi (106 tripomastigotes vía s.c.) a los 21 días de edad. Dicho procedimiento se reflejó en una infección aguda de menor severidad, que no se acompañaba de cambios en cuanto a los niveles circulantes de IFN-g endógeno y anticuerpos líticos anti-T.cruzi, aunque sí se verificó una significativa reducción en las concentraciones séricas de IL-6 biológicamente activa. Experimentos con macrófagos peritoneales demostraron, asimismo, que el tratamiento sistémico con IFN-g tornaba a estas células menos permisivas hacia la infección in vitro con el parásito sin que ello se correlacionara con una mayor producción de oxido nítrico (NO). En lo referente a los efectos a largo plazo la administración del IFN-g durante la enfermedad aguda logró revertir la inversión en el balance de células CD4:CD8 de la etapa crónica sin modificar la extensión y las características de la lesión inflamatoria miocárdica que se observa en un 60-70% de las ratas, a los 180 días p.i. El hecho de que el IFN-g más antimonio a la mitad de la dosis terapéutica había sido efectivo en la Leishmaniasis humana, nos alentó a estudiar la administración de IFN-g en combinación con dosis subóptimas y potencialmente menos tóxicas de benznidazol -BZL- (20% de la dosis curativa mínima en ratas). Dicha estrategia permite un control casi total de la enfermedad aguda a la vez que modifica los niveles séricos de mediadores biológicos relevantes en el curso de la infección aguda, entre ellos los de NO2- que aparecieron significativamente descendidos. Estudios in vitro para determinar si el BZL podía influir sobre la capacidad secretoria de células hospederas del T.cruzi, habían indicado que el BZL reducía la síntesis de NO por parte de macrófagos estimulados con LPS y/o IFN-g, vía de una inhibición en la transcripción del gen de la sintetasa inducible del NO. Por otro lado, en el intento de indagar sobre la potencial influencia del curso de una infección por T.cruzi con altos niveles de IFN-g durante la gestación, sobre la eventual infección de los hijos, se efectuaron estudios donde la infección con T. cruzi y el tratamiento con IFN-g en ratas preñadas hacía que sus crías se volvieran prácticamente resistentes a la infección homóloga inducida al destete; lo que estuvo asociado con una síntesis preferencial de IgG2b específica. Experimentos de intercambio de nodrizas indicaron que buena parte de dicha acción protectora se transmitía a través de la leche, puesto que crías nacidas de ratas sin tratar pero amamantadas por madres infectadas y tratadas con IFN-g durante la preñez, desarrollaban una enfermedad aguda muy atenuada.

8. Actividad citotoxica T inducida por antígenos del Mycobacterium leprae en pacientes con lepra. Su regulación por citoquinas. M. del C. Sasiain, S. de la Barrera, S. Fink, M. Finiasz, M. H. Fariña, G. Pizzariello, R. Valdez.
Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Nacional de Medicina; Hospital de Clínicas José de San Martín, UBA

La lepra es una enfermedad infecciosa crónica producida por el Mycobacterium leprae que presenta un amplio espectro clínico estrechamente relacionado con la inmunidad, con una anergia selectiva al M.leprae en los pacientes lepromatosos. Se producen episodios reaccionales que conducen al daño nervioso. El reservo- rio natural del M.leprae son los macrófagos y las célu- las de Schwann. Si bien la lisis de estas células por linfo- citos T citotóxicos (LTC) sería útil para la eliminación del reservorio, podría participar en el daño nervioso observado. Hemos demostrado que el M.leprae induce LTC capaces de lisar macrófagos autólogos que presentan antígenos micobacterianos. Los pacientes con lepra multibacilar (MB) desarrollan menor citotoxicidad (Cx) que los paucibacilares (PB) y controles normales (N). Al estudiar la modulación de los LTC por citoquinas se observó que el IFNg y la combinación de IL-6 e IFNg aumentaban la Cx en PB, MB y controles normales, mientras que la IL-4 inhibía dicha respuesta, pudiendo ser revertida por el agregado simultáneo de IFNg. Se observó que el M.leprae inducía LTC CD4 y CD8. En MB y en N, la Cx de la población CD4 era mayor, en cambio, en los PB predominaba la Cx a CD8. Las CKs IL-6, IL-2 o IFNg modularon de forma diferencial la Cx de ambas poblaciones linfocitarias en los pacientes con lepra, sugiriendo que la acción conjunta de IL-6 con IL-2 o IFNg, podrían tener un papel importante induciendo la generación de LTC específicos al M.leprae en MB. Entre los antígenos micobacterianos se encuentran las proteínas de shock calórico (heat shock proteins, hsp), conservadas a lo largo de la evolución y altamente inmunogénicas. Demostramos que los pacientes MB no generaban Cx a la hsp65 del M.leprae, sólo aquellos pacientes MB con episodios reaccionales generaban LTC hsp65 específicos. Los pacientes PB presentaron fuerte Cx a esta hsp. La falta de Cx en los MB fue revertido por el agregado exógeno de IFNg, TNFa e IL-12 y la neutralización de IL-4 durante la generación de LTC. El TNFa, el IFNg e IL-12 debían estar presentes en las etapas tempranas de la estimulación antigénica para el completo desarrollo de Cx hsp65 específica, sugeriendo que la fuente temprana de estas citoquinas serían las células NK y/o los linfocitos T gd. En trabajos realizados con CM deplecionadas de NK y Tgd, observamos que estas células regularían la actividad citotóxica a través de su producción de citoquinas y/o generación de células citotóxicas NK-like.