PROLIFERACION, TUMORIGENESIS Y PROGRESION TUMORAL

Coordinador: MA Jasnis

9. Una nueva función del complemento: su contribución a la proliferación y a las complicaciones de la diabetes. J A Halperin.
Harvard Medical School, Boston, MA, USA.

La apertura transitoria del poro formado por el complejo de ataque del complemento (MAC) en membranas celulares libera factores de crecimiento (J Exp Med, 179:985, 1994; Mol Med, 2:755, 1996). Este hallazgo explica la frecuente asociación entre depósitos del MAC y la excesiva proliferación celular que se observa en los tejidos patológicos de muchas enfermedades proliferativas. Dado que el complemento estimula la proliferación celular y que la proteína reguladora del complemento CD59 restringe el deposito de MAC autologo, postulamos que la ausencia o la inac-tivacion de CD59 incrementaría tanto los depósitos del MAC como la proliferación celular asociada y que este mecanismo podría generar patologías proliferativas. Una proliferación celular patológica es característica de las complicaciones vasculares de la diabetes humana. Asimismo, el incremento de la glicación de proteínas que ocurre en esta enfermedad interfiere con la función de algunas proteínas. En consecuencia, investigamos si la glicación no enzimática del CD59 inactiva a esta proteína y contribuye de esta manera con la producción de las complicaciones vasculares de la diabetes. En este trabajo presento evidencia experimental de que: 1) el sitio activo de CD59 contiene un sitio preferente de glicacion (lys41-his44); 2) hay CD59 glicada en la orina humana indicando que la proteína es glicada in vivo 3) la glicación in vitro de CD59 purificado de glóbulos rojos humanos inhibe la actividad anticomplementaria del CD59 y 4) la mutación puntual del residuo lys41 del CD59 humano elimina la sensibilidad de la proteína a la inhibición por glicación; 5) existen depósitos del MAC en los glomérulos y arterias del rincón diabético. Estos hallazgos son consistentes con nuestra hipótesis que el complemento juega un papel patogénico en las complicaciones crónicas de la diabetes: la glicacion inactiva al CD59, lo que genera un aumento en los depósitos del MAC con la consecuente liberación de factores de crecimiento del endotelio que resulta en mayor proliferación celular en la pared vascular. De particular interés es el hecho que el residuo his-44 del CD59 esta presente solo en la proteína humana y no en la de ninguna otra especie. Proponemos que esta peculiaridad del CD59 humano explica a nivel molecular la exclusiva propensión de los humanos a desarrollar complicaciones vasculares de la diabetes, las cuales no se observan en ninguna otra especie.

10. Receptores hormonales y crecimiento tumoral en cáncer de mama murino. C Lamb, A Molinolo, Claudia Lanari.
Instituto de Biología y Medicina Experimental, Buenos Aires

En el laboratorio hemos generado varias líneas tumorales murinas in vivo, progestágeno-dependientes (PD), que expresan receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP), a partir de carcinomas mamarios ductales metastásicos. De éstas obtuvimos variantes que no requieren del progestágeno para crecer (progestágeno-independientes; PI), las que siguen expresando receptores hormonales (Int J Cancer 43: 845-850, 1989; 49: 900-905, 1991 y 59: 196-203, 1994). La presencia de RP en líneas que no necesitan el ligando para proliferar, nos indujo a investigar qué papel juegan los receptores en tumores PI. Los objetivos de este trabajo fueron a) comparar los parámetros de unión al ligando de los RP en tumores PI y PD; b) investigar si en tumores PI el crecimiento es inhibido con antiprogestágenos (AP) y con oligonucleótidos antisentido de RP (ASRP); c) investigar si en tumores PD la estimulación de crecimiento por bFGF o suero fetal bovino (SFB) en concentraciones crecientes, puede ser también inhibida por AP y ASRP. El análisis de RE y RP por técnicas bioquímicas no reveló diferencia de Kd ni de cantidad entre receptores de tumores PD y PI. En estudios in vivo, los tumores PI (n=3, 25-50 mm2) regresionaron completamente o fueron inhibidos por tratamiento con los AP onapristona (10 mg/kg/día) o mifepristona (6,75 mg/kg/día). En cultivos primarios in vitro, el tratamiento con ASRP (20-0.16 mg/ml), inhibió la incorporación de 3H-timidina de las células tumorales (p<0.01) en condiciones en las que los oligonucleótidos sentido (control) no indujeron cambios. En cultivos primarios PD, el bFGF (100 ng/ml) o concentraciones crecientes de SFB estimularon la proliferación celular en forma análoga al acetato de medroxiprogesterona (MPA) 10 nM. Esta estimulación fue inhibida por onapristona y mifepristona, 10 nM, y por ASRP (20-0.16 mg/ml). La efectividad del ASRP para inhibir la síntesis de RP se demostró indirectamente en experimentos de unión de 3H-R5020, donde se observó una disminución del 59,3±14% de pegado. Se demuestra que a) los parámetros de unión de los RE y RP son similares en tumores PD y PI, b) el crecimiento tumoral PI puede ser inhibido por antiprogestágenos cuyo mecanismo de acción es diferente y por ASRP, c) el bFGF puede reemplazar al MPA en el crecimiento PD y el mismo puede ser inhibido por AP o ASRP. El RP es un punto primordial en la regulación del crecimiento. Aún en ausencia del ligando esta vía puede ser activada por caminos esti-mulatorios alternativos, y esta posibilidad podría constituir uno de los caminos de la adquisición de la hormono-independencia.

11. Modelo de carcinoma mamario inducido en ratas por la administración vía i.p de n-nitroso-n-metilurea (NMU). Elena Rivera, Gabriela Martin, Graciela Cricco, Claudia Cocca, C. Davio, Bibiana Lemos, C. Fitzsimons, Alicia Gutierrez, Rosa Bergoc.
Laboratorio de Radioisótopos, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.

Los tumores experimentales desarrollados en este modelo son carcinomas ductales, invasivos, poco metastásicos e histológica-mente de variedad cribiforme, papilar o comedo carcinomas. La caracterización de distintos tipos de receptores indica que todos los tumores presentan receptores a estrógeno (RE), a proges-terona (RPg), a prolactina (RPrl), a factor de crecimiento epidérmico (REGF) e insulínico tipo I (RIGF-I) y receptores de tipo H1 y H2 a histamina (RH1, RH2). A través de la ovariectomía y estudios in vivo e in vitro se demuestra que el 40% de los tumores son dependientes del E2 para su desarrollo y crecimiento (HD). Independientemente de su respuesta al E2 todos son dependientes de histamina (His) y estimulados por EGF. Basándose en estas características el modelo resulta de gran utilidad para el estudio de mecanismos de acción de distintos factores reguladores del crecimiento. En este sentido, es el primer modelo experimental en que se ha demostrado la acción de la histamina como factor autocrino de crecimiento. La clave de este mecanismo la constituye a) cambios en la regulación de la expresión de la histidina decarboxilasa y contenido endógeno de His, que escapa del control estrógenico característico en la glándula mamaria normal y pasa a estar regulado por la His; b) cambios en la asociación de los RH1 y RH2 a los segundos mensajeros intracelulares, con la consecuente activación de vías metabólicas relacionadas con la proliferación. La dependencia hormonal de los tumores presenta características particulares. En los HD el E2 regula la proliferación celular, la expresión de ARNm de RPg, y de c-myc. En los estrógeno independientes (HI) la expresión de c-myc y RPg no es modulada por E2, y el contenido de TGFa/EGF es regulado por Pg. La inducción de este modelo tumoral en ratas diabéticas (mediante la inyección de streptozotosina 90 mg/kg al 2do día de vida), demostró el desarrollo de tumores con marcado patrón de benignidad posibilitando el estudio de la interacción entre diferentes hormonas y factores de crecimiento, principalmente de tipo insu-línico. Los tumores desarrollados en ratas diabéticas presentan RIGF-I los que se sobreexpresan en tumores HI. Finalmente, este modelo ha sido empleado con éxito para el desarrollo de drogas con actividad antiestrogénica, así como también para el estudio de efectos biológicos de radiaciones ionizantes. En este sentido se investiga actualmente la acción radiosensibilizante o radioprotectora de distintas drogas con potencial uso en radioterapia.

12. Determinantes Críticos de la Progresión Tumoral. Elisa Bal de Kier Joffé, A. Urtreger, J. Aguirre Ghiso, Lydia Puricelli, Eugenia S. de Lustig, , A. Muro, Fabiola Porro, S. Werbajh, A. Kornblihtt.
Area Investigación, Instituto de Oncología A.H. Roffo, ICGEB (Trieste, Italia) y Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA.

En diferentes etapas de la progresión tumoral la célula maligna establece interacciones con componentes de la matriz extracelular (ECM) como la fibronectina (FN), cuya alteración se ha vinculado con la adquisición de los fenotipos tumorigénico y metastásico. Hace unos años demostramos una correlación inversa entre la expresión de FN y el potencial metastásico en un modelo de adenocarcinomas mamarios murinos. Así, mientras que los cultivos primarios del tumor M3, moderadamente metastásico en pulmón, mostraban una ECM de FN y niveles elevados de ARNm, en los cultivos de la variante altamente metastásica MM3 no se detectó la red de FN fibrilar extracelular ni ARNm por mapeo con nucleasa S1, sin alteraciones a nivel del gen en ambos casos. Recientemente hemos estudiado las bases moleculares de esta falta de expresión de FN. Utilizando un método más sensible, como es RT-PCR, se pudo establecer que las células MM3 expresan niveles de ARNm de FN 40 veces menores que M3 y presentan un patrón alterado de splicing alternativo. El análisis conformacional de ADN de simple cadena (SSCA) no mostró alteraciones en la secuencia de bases del promotor proximal. Mediante transfecciones transitorias con construcciones del promotor de FN y el gen reporter CAT, demostramos que los bajos niveles de ARNm FN se deben a una reducción de la transcripción que involucra la participación de la región 220 bp del promotor proximal. Por otra parte, la línea LM3, obtenida a partir de M3, perdió su capacidad de expresar FN a partir del repique 30, asociándose esta pérdida con la adquisición de un fenotipo más invasivo y metastásico. La línea celular LMM3, derivada de MM3 e incapaz de expresar FN, fue transfectada mediante diferentes construcciones del gen de FN plasmática humana. Se obtuvieron clones capaces de expresar FNwt o FN con mutaciones a nivel del principal sitio de unión a células RGD, que fueron detectadas a nivel citoplasmático o en el medio de cultivo, pero no en la ECM. La re-expresión de FN, wt o mutada, se asoció con una mayor adhesión a plástico, pero no a FN, con alteraciones en la producción de uroquinasa y con una inhibición de la migración y de la angiogénesis. Finalmente, la inoculación de los clones en ratones singeneicos mostró una significativa reducción en la capacidad metastásica asociada a la re-expresión de FN, pero independiente de RGD y de la formación de ECM. Nuestros resultados aportan nuevas evidencias que avalan la participación de la FN como determinante molecular crítica de la progresión tumoral.