ESTABILIDAD DE LA VACUNA CANDID#1 PARA PREVENIR LA FIEBRE HEMORRÁGICA ARGENTINA

La fiebre hemorrágica argentina es una enfermedad aguda producida por el virus Junín1, 2 para cuya prevención existe una vacuna a virus Junín vivo atenuado. La cepa atenuada Candid#13 ha dado su denominación a la vacuna. Esta vacuna es considerada una droga “huérfana”4 ya que está destinada a una enfermedad de muy baja prevalencia y de circulación restringida a un área geográfica reducida, por lo que su comercialización no recupera los costos de desarrollo, producción y distribución. Este tipo de producto, por consiguiente, no es de interés para la industria farmacéutica y generalmente su producción es asumida por ONGs o por los gobiernos de cada país. Esta condición fue anticipada desde el desarrollo de Candid#1, por lo que fue previsto que, en Argentina, el productor de esta vacuna fuera el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. Julio I. Maiztegui (INEVH-ANLIS)5-7, dependiente del Ministerio de Salud de la Nación.

Candid#1 se obtiene por cosecha de sobrenadantes de cultivos de células diploides infectados con la semilla vacunal3. Estos sobrenadantes son formulados y dosificados para ser sometidos a un proceso de liofilización. Luego de la realización del ensayo clínico puente diseñado para comparar la vacuna Candid#1 producida en Argentina con la producida en EE.UU. se obtuvo el registro de la misma por la Autoridad Regulatoria Nacional (Resolución de ANMAT N ° 4882, Agosto 2006), y en 2007 fue incorporada al Calendario Nacional de Inmunizaciones8, 9.

La utilización de las vacunas implica su llegada a la población blanco en las mismas condiciones en que se ha determinado su capacidad inmunizante. Para ello se deben desarrollar estrategias de distribución y almacenamiento de las vacunas basadas en sus condiciones de estabilidad10, 11. La estabilidad de un producto farmacéutico se define como la capacidad para conservar sus propiedades químicas, físicas, microbiológicas y biofarmacéuticas a lo largo de su tiempo de conservación dentro de límites especificados.

Existen dos tipos de factores que afectan la estabilidad de las vacunas: (i) los factores intrínsecos que están relacionados con los procesos de su fabricación y los componentes de la vacuna; y (ii) los factores externos o extrínsecos, donde se puede intervenir minimizando o eliminado aquellos que pueden afectar la estabilidad.

La temperatura es sin duda el factor que más puede afectar la estabilidad. Cuando la vacuna es expuesta a temperaturas por encima o por debajo de lo recomendado se produce pérdida de su potencia. El daño que ocasione la temperatura estará en relación directa al tiempo de exposición y a las características de la vacuna (liofilizada o reconstituida). En virtud de lo expuesto y de la natural termolabilidad de los arenavirus, y particularmente del virus Junín, se diseñó un programa de ensayos para determinar las condiciones de temperatura en que se debe conservar esta vacuna a fin de preservar sus atributos originales. Este programa fue parte del protocolo de desarrollo de Candid#1 y respondió a requerimientos de la autoridad regulatoria argentina12.

Presentamos aquí los resultados de los ensayos con Candid#1 liofilizada y reconstituida realizados en tiempo real entre 2004 y 2014 para definir las condiciones adecuadas de almacenamiento y distribución y establecer su período de vida útil.

Materiales y métodos

Fueron empleados el Lote A1, el Lote A2 y el Lote A3 de la Vacuna Candid#1 (XJ Cob2 Cer R44 FRhL– 219) producida en INEVH-ANLIS (REM N° 53205, Disposición ANMAT N° 4882). Cada frasco de vacuna fue reconstituido en 5.5 ml de diluente, equivalente a 10 dosis de vacuna por frasco. El diluente de la vacuna (ampollas de agua estéril para inyección) fue producido en el INEVH-ANLIS (REM N° 51663, Disposición ANMAT N° 5399).

Las células Vero (ATCC-CCL81), células epiteliales de riñón de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) certificadas, se utilizaron para la prueba de potencia entre los pasajes 32 y 42.

El esquema de trabajo fue: Los lotes A1, A2 y A3 de vacuna Candid#1 liofilizada fueron inicialmente almacenados entre -28 °C y -30 °C. Desde estas condiciones de temperatura fueron muestreados entre 39 y 41 viales de cada lote para el estudio a diferentes temperaturas de almacenamiento como se esquematiza en la Tabla 1:

a) Vacuna reconstituida. Se reconstituyeron 8 viales de vacuna de cada lote y, antes de ser guardados en la heladera (2 °C a 8 °C), se observó el aspecto de cada uno de ellos. Se retiró de la heladera un frasco por día durante 8 días, que se guardó a -70 °C para la posterior determinación de potencia.

b) Vacuna liofilizada, temperatura de almacenamiento 2 °C a 8 °C. Se guardaron en la heladera 6 viales de vacuna liofilizada de cada lote y se retiró un frasco por mes durante 6 meses, luego fueron almacenados a -70 °C para la posterior determinación de potencia.

c) Vacuna liofilizada, temperatura de almacenamiento -18 °C a -20 °C. Se guardó a dicha temperatura una cantidad suficiente de viales de vacuna liofilizada y se retiró un vial de vacuna de cada lote cada 6-12 meses durante 10 años, entre -18 °C y -20 °C para determinación de potencia, humedad residual, pH y osmolaridad.

d) Vacuna liofilizada, temperatura de almacenamiento -28 a -30 °C. Se controló un vial de vacuna de cada lote cada 6-12 meses durante 5 años a la temperatura original de almacenamiento para determinación de potencia, humedad residual, pH y osmolaridad.

Para el ensayo de potencia13 se realizó la titulación de la vacuna Candid#1 mediante la inoculación de diferentes diluciones de la misma en células Vero, y posterior agregado de una cubierta de agarosa y colorante supravital, lo que permitió

visualizar las áreas focales de infección (placas) y realizar su conteo. Se utilizó como testigo una cepa de referencia interna Candid#1. La prueba se consideró válida al evaluar el título del virus de referencia y compararla con la Carta Control. Se utilizó como guía las reglas de Westgard14 sobre Cartas de Control de Shewart15. La especificación de potencia para la vacuna Candid#1 es entre 1.00 × 104 y 9.00 × 105 UFP/ml.

La osmolaridad fue determinada mediante el método de depresión en el punto de congelamiento16. Se utilizó el osmómetro Advanced Modelo 3250, con certificado de calibración vigente (especificación: 260-330 mOsm/kg).

La humedad residual fue determinada mediante el método Karl Fisher17. Se utilizó el titulador Mettler Toledo DL31, con certificado de calibración vigente. La técnica consiste en someter un electrodo de platino a una corriente eléctrica constante. El iodo adicionado reacciona con el agua presente en la muestra. El punto final es el iodo libre en la solución, ese iodo libre transporta electrones, solución conductora. Para mantener la corriente constante la tensión se reduce. La reducción del valor de la tensión a un cierto valor es la indicación del punto final de la valoración. Especificación: < 3%.

El pH fue determinado mediante el método potencio-métrico18. Se utilizó un peachímetro calibrado, con especificación pH 6.5-7.5.

Las temperaturas -18 °C a -20 °C y -28 °C a -30 °C fueron supervisadas en las respectivas cámaras de modo continuo mediante el sistema SCADA (Supervisory, Control and Data Adquisition) (Excel Building Supervisor, Versión 1.4.3. Marca Honeywell).

Resultados

No se detectó ningún parámetro anormal en el aspecto (turbidez, color, partículas) de cada uno de los viales reconstituidos de vacuna conservada entre 2 °C y 8 °C. Con respecto al ensayo de potencia, la vacuna Candid#1 reconstituida resultó estable entre 2 °C y 8 °C durante 8 días manteniendo un título de virus entre 1.00 × 104 y 3.13 × 104 UFP/ml (Tabla 2).

La potencia de la vacuna liofilizada conservada entre 2 °C y 8 °C se mantuvo entre 1.15 × 104 y 3.13 × 104 UFP/ml

durante dos meses. A partir del tercer mes, la potencia disminuyó a valores por debajo de la especificación para Candid#1 (< 1.00 x 104 UFP/ml) (Tabla 3).

La vacuna liofilizada conservada entre -18 °C y -20 °C mantuvo títulos virales por encima de 1.02×104 UFP/ml durante los 10 años del estudio (Tabla 3). El pH y la humedad residual también se mantuvieron dentro de valores aceptables (Tabla 4). La osmolaridad se mantuvo dentro del rango de la especificación del producto hasta los 9 años, pero a los 10 años descendió a valores inferiores a 260 mOsm/kg en dos de los tres lotes estudiados (Tabla 4).

La vacuna liofilizada conservada entre -28 °C y -30 °C mantuvo el título de virus entre 1.00 × 104 y 3.62 × 104 UFP/ml durante 5 años (Tabla 3), tiempo que estuvo almacenada según las indicaciones de los desarrolladores del producto, manteniendo el pH, la humedad residual y la osmolaridad dentro del rango de la especificación del producto (Tabla 4).

Discusión

En el desarrollo de inmunógenos, y de medicamentos en general, uno de los objetivos centrales es obtener una preparación eficaz que pueda llegar a cada población blanco con sus propiedades intactas. Para ello, los estudios de estabilidad miden el efecto de los factores fisicoquímicos, biofarmacéuticos y biológicos, y las condiciones ambientales (humedad, temperatura, oxígeno, luz, entre otras) sobre los principios activos durante la elaboración, el almacenamiento, el transporte y la utilización de los productos médicos. En el caso de la vacuna de virus Junín vivo atenuado Candid#1, la temperatura a la que se expone el producto durante las etapas mencionadas es de importancia decisiva dada la termolabilidad del virus Junín, característica común a todos los arenavirus.

En este trabajo se presentan los resultados de la exposición de Candid#1 como producto terminado (liofilizado y reconstituido) a diferentes temperaturas durante variables períodos de tiempo, como parte de un plan integral de estudio de su estabilidad. Los primeros ensayos consistieron en determinar la temperatura de almacenamiento del producto terminado (vial de diez dosis) en la planta de producción, para lo cual se utilizaron cámaras a -28 °C a -30 °C siguiendo las indicaciones de los desarrolladores del producto. Las determinaciones de la potencia y otros parámetros realizadas durante 5 años demostraron que en esas condiciones la vacuna mantenía intactas sus propiedades. Simultáneamente, se realizaron estudios a temperatura de refrigerador (2 °C a 8 °C) para fijar las condiciones de uso de Candid#1 en los vacunatorios, determinándose que esta vacuna puede ser mantenida reconstituida en estas condiciones durante 12 horas. Como producto liofilizado, Candid#1 puede ser almacenada en refrigerador durante 60 días.

Esos resultados representaron desafíos para la implementación de las campañas de vacunación con Candid#1, ya que el almacenamiento prolongado de la vacuna debía realizarse entre -28 °C y -30 °C, condiciones difíciles de lograr en los ambientes rurales donde se la administra. Para abordar estas dificultades, se analizó la posibilidad de utilizar freezers de tipo doméstico (-18 °C a -20 °C) para la conservación de Candid#1 en los centros de vacunación. Las determinaciones anuales de los diferentes parámetros demostraron que el producto mantuvo el título de virus original durante todos los diez años que duró el período de observación y solo su osmolaridad redujo por debajo de los valores especificados el décimo año de almacenamiento.

Durante el desarrollo de Candid#1 se determinó que la forma liofilizada sería la más conveniente para lograr la estabilidad prolongada del producto, ya que este proceso reduce el potencial daño al virus Junín causado por hidrólisis, agregación, desnaturalización, degradación y fluctuación del pH, los riesgos habituales de las presentaciones líquidas. También se especuló con la posibilidad de conservar esta vacuna a temperatura de refrigerador (2 °C a 8 °C) como ocurre con otros inmunógenos10. Los resultados indicaron que solo se puede almacenar Candid#1 liofilizada en estas condiciones durante 60 días, mientras que la misma presentación puede ser almacenada durante 9 años entre -18 °C y -20 °C. Estos resultados demuestran que la vacuna Candid#1 es un producto de muy prolongada estabilidad, que la temperatura de almacenamiento es el factor determinante de su vida útil y que, por consiguiente, la supervisión de la cadena de frío de esta vacuna es de fundamental importancia. La presentación de los resultados aquí descriptos ante la autoridad regulatoria nacional dio lugar a la Disposición ANMAT N° 1687 (Febrero 2017) en la que se aprueba un período de 9 años como vida útil de la vacuna Candid#1 liofilizada conservada entre -18 °C y -20 °C.

Agradecimientos: A los técnicos de cultivos celulares y control de calidad y a la Srta. Natalia Giovannoni por su ayuda en la compaginación del trabajo.

Conflicto de intereses: Ninguno para declarar

Bibliografía

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