Respuesta inmune y terapia génica con vectores virales adenoasociados

La terapia génica es una disciplina que busca la inserción de material genético para el tratamiento o corrección de una enfermedad. Esta inserción puede realizarse ex vivo, tratando células del individuo con el gen de interés en el contexto del laboratorio, siendo posteriormente suministradas al paciente. Esta modalidad fue utilizada en los primeros tratamientos para la inmunodeficiencia grave combinada ligada a X durante la década de 1990 e inicios del siglo 21. En la modalidad in vivo la inserción del material genético se realiza de manera directa utilizando un vector ¹. La terapia génica in vivo tiene el potencial de aumentar la eficiencia y aumentar el espectro de aplicaciones con respecto a la terapia ex vivo ².
Las estrategias de transferencia génica in vivo se caracterizan por tres elementos: el gen a transferir, el tejido blanco en el que se introduce el gen, y el vector, el cual se utiliza para facilitar la entrada del gen ³. Existen varias consideraciones para escoger el vector más apropiado, como el potencial de unión y entrada a la célula diana, la transferencia adecuada del material genético al núcleo, la habilidad de expresión prolongada del inserto y la ausencia de toxicidad ⁴.
Dentro de los vectores que se pueden utilizar para la transferencia del material genético se encuentran los virus y vectores no virales. Algunos de los vectores virales utilizados han sido lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV) y virus de herpes simplex ^{1, 5}. Los vectores no virales incluyen inyección directa de ácido desoxirribonucleico (ADN), ya sea en plásmidos o productos desnudos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) utilizando dispositivos como electroporación, sonoporación, magnetofección o pistolas de genes para facilitar su entrada a la célula y núcleo ¹.
Debido a su pobre inmunogenicidad, su bajo riesgo de mutagénesis insercional y su buen perfil de seguridad, los vectores AAV constituyen una gran opción terapéutica.
Actualmente son ampliamente utilizados en terapia génica para la transferencia de genes de interés en estudios preclínicos y ensayos clínicos de patologías monogénicas ⁵.
A finales de 2017 la terapia de reemplazo genético del gen RPE65 para el tratamiento de la amaurosis congénita de Leber utilizando el serotipo AAV2 en administración sub-retinal (Luxterna, Spark therapeutics), se convirtió en la primera terapia génica con vectores AAV en ser aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) en EE.UU. ^{6, 7}. En mayo de 2019 la FDA aprobó la terapia de reemplazo genético del gen SMN1 utilizado el vector AAV9 para el tratamiento de la atrofia muscular espinal en pacientes menores de 2 años (Zolgensma, AveXis Inc.) ^{8, 9}. La aprobación inicial es para la administración por vía intravenosa en pacientes de hasta 2 años de edad; sin embargo, AveXis está llevando a cabo estudios clínicos para la administración intratecal de zolgensma en pacientes con atrofia muscular espinal de hasta 5 años de edad ¹⁰. También se está evaluando la efectividad de la transferencia genética en pacientes con hemofilia A (BioMarin Pharmaceutical). En un estudio clínico fase I que evaluó el efecto de una dosis intravenosa única de un vector AAV5 optimizado, que codifica para el factor VIII, en nueve hombres con hemofilia A grave se observó la normalización sostenida de la actividad del factor VIII, con estabilización de la hemostasia y una profunda reducción en el uso del factor VIII ¹¹. Todos estos resultados validan el potencial terapéutico de los vectores AAV para el tratamiento de diversas clases de enfermedades.

Características de los virus adenoasociados

Los AAV son virus de ADN, de 25 nm, de la familia Parvoviridae y el género Dependovirus. El genoma de los AAV es linear, de 4.7 kilobases (Kb), contiene dos secuencias palindrómicas invertidas en su región terminal (ITR, por sus siglas en inglés) flanqueando dos genes: el gen Rep, el cual codifica las enzimas necesarias para la replicación, la actividad endonucleasa y la actividad ATPasa y el gen Cap, que produce las tres proteínas de la cápside viral.
Estas proteínas en la cápside viral diferencian los serotipos de AAV y les confieren diversos tropismos tisulares ^{4, 12, 13}. Hasta ahora se han descubierto 12 serotipos de AAV humanos (AAV1-AAV12) y 100 de primates no humanos, cada uno de ellos con un tropismo celular característico ^{4, 14} (Tabla 1).
El ciclo de vida de los AAV tiene dos etapas: lítica y lisogénica. Una infección productiva (ciclo lítico) por AAV solo puede ocurrir en presencia de un virus adyuvante, ya sea un adenovirus o herpesvirus; en esta etapa ocurre replicación activa, expresión de genes virales y producción de viriones. En ausencia del virus adyuvante el AAV entrará a ciclo lisogénico, en el cual se limita la replicación y la expresión de genes virales; en este ciclo el genoma de los AAV puede integrarse de manera específica al cromosoma 19 en la región q13.4, estableciendo latencia hasta que se produzca una infección por adenovirus o herpesvirus, en cuyo caso el AAV entrará a ciclo lítico. La integración específica del genoma viral al cromosoma 19 depende de proteínas codificadas por el gen Rep. Para evitar el riesgo de mutagénesis insercional, y debido al tamaño de la secuencia, cuando se diseña un vector viral utilizando AAV se reemplazan los genes Rep y Cap por el gen de interés conservando solo las regiones ITR, las cuales son fundamentales para la replicación del material genético ⁴.

Respuesta inmune contra los virus adenoasociados

A pesar de que la infección por AAV ha sido detectada en diversos tejidos, tanto en animales como en humanos, hasta el momento no se han asociado con ninguna patología ¹⁵. Los AAV se encuentran libremente en la naturaleza, por lo cual los humanos y los modelos animales de experimentación utilizados en investigación biomédica pueden haber tenido exposición previa a algunos de los serotipos de AAV y por tanto generar respuesta inmune celular y humoral ^{16, 17}. A nivel inmunológico, la cápside del vector AAV es una réplica del virión encontrado en la naturaleza por lo que la administración del vector genera la activación de la respuesta inmune frente a proteínas de la cápside del virus tanto en los pacientes previamente expuestos a los AAV como en aquellos sin exposición previa ^{4, 17}. La presencia de respuesta inmune contra la cápside impide el acoplamiento y entrada del material genético a las células de interés, por esta razón es una de las principales barreras, tanto para el tratamiento inicial como para a readministración del vector ¹⁸. No obstante la similaridad de la cápside entre los vectores y los AAV presentes en la naturaleza, la administración del vector difiere de la infección natural en tres aspectos: la introducción de un número mayor de partículas virales al organismo, la ruta de la administración (la exposición natural a AAV usualmente se lleva a cabo por vía aérea) y, por último, la no replicación activa del AAV dada a la ausencia de adyuvante, lo cual disminuye la respuesta inmune generada ¹⁵.

La primera línea de respuesta que desencadena la infección por AAV es mediada por el sistema inmune innato.
El sistema inmune innato reconoce secuencias evolutivamente conservadas ajenas al huésped (PAMPs por sus siglas en inglés, pathogen-associated molecular pattern) mediante receptores de reconocimiento de patógenos, generando un aumento en secreción de citoquinas y quimoquinas y un aumento de moléculas coestimulatorias, induciendo o modulando el sistema inmune adaptativo.
Los PAMPs presentes en los AAV son reconocidos por los Toll-like receptors tipos 2 y 9 generando respuesta inmune mediada por el factor nuclear Kappa Beta y secreción de interferón tipo I, respectivamente ¹⁷.
La infección por AAV también genera respuesta adaptativa celular mediada principalmente por linfocitos T-CD8+19. Estudios de monitoreo de reactividad de células T hacia la cápside del AAV2 muestran que alrededor de dos tercios de adultos mayores de 25 años presentan células T que responden a péptidos de la cápside del AAV2; de la misma manera, se han reportado frecuencias de 30% de células T reactivas contra epítopes de AAV1 en población sana ^{20, 21}. Debido a que los vectores AAV son no replicativos, se asume que la cápside permanece inmunológicamente detectable en una célula por un período definido del tiempo, que varía de semanas a meses según el tejido diana, alterando la respuesta celular ²⁰.
Se ha descrito que, la infusión de un vector derivado del serotipo AAV2 en hepatocitos provoca una expansión clonal de linfocitos T-CD8+ específicos para la cápside del virus ¹⁹. A pesar de este conocimiento, las implicaciones y mecanismos de esta respuesta inmune aún no están del todo dilucidados, y, por lo tanto, son necesarios mayores estudios sobre la naturaleza y potencia de la respuesta celular, tanto en infección natural, como en el contexto de terapia génica ²¹.
A pesar de que los vectores derivados de AAV pueden generar una respuesta celular, el principal obstáculo para la implementación de terapia génica con vectores AAV es la generación de inmunidad humoral ²². La inducción de anticuerpos por exposición natural a AAV y la repetida exposición a vectores virales en pacientes previamente seronegativos provocan una respuesta humoral potente que compromete la transducción del vector y su persistencia disminuyendo la expresión del transgen ^{23, 24}.
La exposición natural a AAV resulta en la producción de anticuerpos tipo IgG, en especial de la subclase IgG1 ^25-27.
Esta respuesta humoral inmune puede ser de dos tipos: neutralizante o no neutralizante. Los anticuerpos neutralizantes (NAbs por sus siglas en inglés) reconocen epítopes en la cápside del virión inhibiendo la transducción del AAV a las células diana. Por otra parte, los anticuerpos no neutralizantes se unen al virus, marcándolo sin bloquear la transducción celular ^{15, 24}. Los primeros ensayos clínicos que buscaban la transducción hepática de vectores AAV en pacientes con hemofilia B demostraron que los NAbs son el principal factor a superar para el establecimiento y mantenimiento de la terapia ¹⁹. Se ha descrito que títulos relativamente bajos, de hasta 1:17, neutralizan por completo grandes dosis de vector, por lo cual no hay detección de la expresión del gen28. Estudios posteriores sugieren que títulos incluso más bajos (1:5-1:10) pueden impedir la transducción completa del vector en el órgano diana y alterar su biodisponibilidad, aumentando la transducción en bazo y nódulos linfáticos ^{27, 29}. Esta inhibición por NAbs también es dependiente de la vía de administración: la administración del vector por vía intratecal, o directamente en ojo o músculo parece ser menos susceptible a la acción de los NAbs ³⁰. Debido al efecto de los NAbs en la respuesta terapéutica deseada al infectar con el transgen, pacientes con títulos positivos de anticuerpos (incluso tan bajos como 1:2) son inmediatamente excluidos de la mayoría de los ensayos clínicos con vectores AAV ³¹.
Resulta interesante que las respuestas humoral y celular a la infección con vectores AAV parecen no estar acopladas; sujetos positivos para anticuerpos contra AAV no presentan reactividad celular contra la cápside y, de igual manera, pacientes con reactividad celular tienen menores títulos de anticuerpos contra vectores AAV. Esto sugiere que, posterior a la exposición al AAV, ciertos individuos favorecen una respuesta Th1 al antígeno, mientras otros desarrollan una respuesta Th220. Un resumen de la respuesta inmune frente a la infección con AAV puede encontrarse en la Figura 1.

Estrategias para determinar los niveles de NAbs

Una adecuada identificación no solo de la presencia de NAbs, sino de los títulos y actividad de los NAbs, es de vital importancia en las primeras fases de los ensayos clínicos con vectores AAV. Actualmente, se han descrito tres estrategias para determinarlos: el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), la detección de NAbs in vitro y finalmente la detección in vivo16. En general, todas las técnicas utilizan suero como sustrato para la determinación debido a su facilidad de obtención y a que es altamente indicativo del estado humoral inmune del paciente, sin embargo, otros sustratos como tejidos o líquido sinovial pueden ser utilizados para la caracterización de los NAbs ³⁰. La Tabla 2 presenta las ventajas y desventajas de cada técnica.

ELISA

La técnica de ELISA fue la primera empleada para el estudio de anticuerpos contra AAV, y fue ampliamente utilizada en los primeros reportes generados en la década de los ´70. Para el estudio de anticuerpos contra AAV se utiliza la variante técnica denominada ELISA indirecto, la cual emplea un sistema de detección de doble anticuerpo, con los antígenos de interés fijados en la superficie, un anticuerpo primario que en este caso corresponde al anticuerpo a evaluar y un anticuerpo secundario que revela la presencia de los complejos antígeno-anticuerpo ²⁵. La reducción la señal de luminiscencia o fluorescencia dada por el anticuerpo secundario es la que determina la seropositividad, pues se toma como título positivo la primera dilución en la cual se logra una reducción de la señal en un 50% comparado con la señal emitida en el control.

Determinación de NAbs in vitro

La técnica utiliza diluciones seriadas del suero del paciente que son mezclados con un número fijo de vectores AAV que expresan el gen reportero. Las mezclas resultantes son incubadas con una línea celular permisiva. Posterior a la incubación se mide la eficacia de la transducción viral de acuerdo al nivel de expresión del gen reportero utilizado. El título de anticuerpos es reportado como la dilución más alta que inhibe la expresión del 50% del gen reportero con relación al control positivo ^16,24,32.
Varios estudios han utilizado esta técnica, no solo para evaluar la presencia previa de NAbs en posibles candidatos a terapias sino también para evaluar posibilidad de reinyección en pacientes donde sea necesario administrar una nueva dosis de virus. Entre estos estudios se encuentran la mayoría de ensayos para terapia génica contra la hemofilia y más recientemente el estudio Cupid-2 en pacientes con falla cardíaca ^{26, 31}.

Determinación de NAbs in vivo

Debido a que el ensayo in vitro no evalúa la neutralización por fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y otros componentes sanguíneos y puede presentar problemas de reproducibilidad, algunos investigadores han desarrollado el ensayo de detección in vivo para evaluar la respuesta inmune y la actividad de los anticuerpos en un modelo animal ^{16, 24}.
La técnica consiste en inyectar varios ratones, cada uno con una mezcla de diferentes diluciones del suero problema de manera posterior o simultánea a una infusión de AAV que expresa un gen reportero y se mide la actividad del gen reportero ^24,33. El título de NAbs es definido como la dilución en la cual se redujo la expresión del transgen un 50% comparado con un ratón control inyectado sólo con el vector ²⁴.

Prevalencia de anticuerpos neutralizantes en la población

Los primeros estudios para determinar la prevalencia de anticuerpos contra los AAV fueron realizados por Blacklow en 1968 ^{34, 35}. A partir de los primeros ensayos clínicos utilizando vectores derivados de AAV, se realizaron estudios de prevalencia de NAbs en población sana y en pacientes con enfermedades específicas ² (Tabla 3). Los serotipos más comunes en investigación básica, preclínica y clínica son los AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 y, por ende, los estudios poblacionales se han centrado en ellos.
Estudios poblacionales en EE.UU. y países de Asia, África, Oceanía y Europa han comunicado diferencias entre las prevalencias de NAbs según el serotipo evaluado y la población estudiada (Tabla 3). La prevalencia de NAbs en población sana, independiente del serotipo, es generalmente mayor en países en vía de desarrollo que en países desarrollados, con excepción de Francia, donde se reporta una alta prevalencia contra AAV1 y de Holanda, donde un estudio reportó un gran porcentaje de seropositividad contra los serotipos AAV1, AAV6, AAV7 y AAV8 ^{21, 27 ,36}. Los factores que pueden explicar este fenómeno incluyen variaciones en condiciones socioeconómicas, de vivienda, densidad poblacional, condiciones higiénicas y acceso a salud entre las poblaciones de los países y regiones y la diferencia en metodología, previamente expuesta, en el ensayo in vitro ²⁴. Cabe anotar que hasta el momento solo se tienen datos de prevalencia de NAbs en población latinoamericana procedentes de un único estudio en población brasileña que empleó la técnica de ELISA ²⁵. El proyecto ANVIAS, actualmente en curso, busca establecer la prevalencia para tres serotipos de AAV en individuos sanos y pacientes con falla cardíaca colombianos, por lo cual pronto se tendrán datos poblacionales de la región ³⁷.
Varios estudios han encontrado diferencias significativas entre diferentes grupos etarios sin importar el serotipo evaluado ^{2, 23, 34, 35, 39, 40, 43, 46}. Los títulos de anticuerpos aumentan con la edad y describen el siguiente comportamiento: desde el nacimiento hasta aproximadamente 6 meses los títulos se mantienen altos debido a la inmunidad pasiva materna, y luego disminuyen hacia los 7-11 meses de edad. Posterior a la maduración del sistema inmune, en el primer año de vida, los títulos comienzan a aumentar, coincidiendo con un aumento de exposición a los AAV presentes en la naturaleza ²⁴.
Existe evidencia conflictiva sobre si hay o no diferencia en la prevalencia de NAbs de acuerdo al sexo. Algunos estudios han descrito prevalencias significativamente mayores de títulos de NAbs contra AAV1 en mujeres comparado con hombres ³⁶, mientras que en otros no se ha encontrado diferencia significativa en las prevalencias o títulos entre hombres y mujeres ^{30, 42, 45}.
Con respecto a la especificidad de la respuesta inmune humoral a la infección con AAV, se ha descrito una fuerte relación en la seropositividad entre diferentes serotipos de AAV. La gran mayoría de sueros (50-100%) presentan seropositividad frente a dos o más serotipos ^{23, 27, 41, 42, 45, 46}.
Esta reactividad cruzada puede deberse a exposición a los diversos serotipos presentes en la naturaleza o bien a reactividad cruzada entre anticuerpos contra solo un serotipo, debido a la homología entre las proteínas de las cápsides ^{4, 41}. Estudios longitudinales recientes con chimpancés parecen favorecer la segunda hipótesis, pues se ha encontrado que la infección por solo un serotipo de AAV induce anticuerpos neutralizantes capaces de neutralizar múltiples serotipos diferentes ⁴⁹.

Estrategias para burlar la presencia de NAbs en la aplicación de terapia génica con vectores adenoasociados

Debido al alto porcentaje de individuos seropositivos y la presencia de reactividad cruzada, se han desarrollado diversas estrategias para la administración de vectores AAV a pacientes con títulos positivos de NAbs. La primera estrategia es la plasmaféresis, en la cual se remueve la sangre y se la separa en sus componentes. La fracción celular se retorna al cuerpo, mientras el plasma es desechado y reemplazado por albúmina. La plasmaféresis ha sido utilizada para reducir niveles de NAbs antes de la administración del vector, y resulta en una disminución de los títulos de 2 a 3 veces por cada sesión de aféresis.
Esta estrategia es especialmente útil en pacientes con bajos niveles de NAbs o pacientes que se seroconvirtieron y requieran readministración posterior del vector ^{20, 24}.
Otra estrategia consiste en minimizar contacto del vector con los NAbs mediante el uso de vías de administración directa en el órgano diana y no en el sistema circulatorio. De esta manera se limita la exposición a NAbs circulantes en plasma, se limita la acción solo al tejido deseado y también se limita la dosis necesaria del vector, reduciendo así su inmunogenicidad. Esta táctica ha sido altamente efectiva utilizando vías de administración muscular, intratecal y ocular ^{20, 47, 50}.

También se ha propuesto la inmunosupresión como un mecanismo para reducir la producción de anticuerpos neutralizantes mediante depleción farmacológica de células B, sin embargo, esta estrategia ha presentado resultados mixtos en modelos animales ^{20, 31}.
Finalmente, se ha propuesto el diseño de cápsides específicas con una combinación de epítopes que no sea reconocida por los anticuerpos. Estas cápsides pueden ser diseñadas según los anticuerpos presentes en los pacientes (terapia personalizada) o para uso como terapia en la población general. Este diseño se basa en la utilización de librerías creadas por PCR prona error y generar vectores que no solo escapen a la neutralización mediada por anticuerpos sino también con tropismo para el tejido de interés. Por el momento la estrategia ha tenido buenos resultados en estudios in vivo con modelos murinos ³³.
A pesar de estos resultados prometedores en modelos animales, ninguna de estas estrategias ha sido aplicada en los estudios clínicos para hemofilia, atrofia muscular espinal o amaurosis congénita de Leber, razón por la cual es importante continuar el estudio de estrategias para disminuir la respuesta inmune y que más pacientes puedan beneficiarse de la terapia génica basada en AAV ^{6, 8, 11}.
En conclusión, los AAV cuentan con un amplio potencial para su uso como vector en terapia génica. El principal obstáculo para la implementación de una terapia con AAV está en la presencia de inmunidad humoral contra las cápsides del vector, cuya prevalencia cambia según la edad, localización geográfica, y estado inmunológico.
Se requieren más estudios poblacionales que midan más de un serotipo y evalúen diferencias entre variables socioeconómicas y clínicas para establecer posibles factores que se asocien a un incremento de la prevalencia AAV y puedan actuar como factores de riesgo en futuros estudios. De igual manera es recomendable tener un protocolo de detección de anticuerpos neutralizantes in vitro estandarizado con la misma línea celular, gen reportero, título de corte para seropositividad y estándares definidos. También es necesario iniciar estudios para evaluar la presencia de inmunidad celular previa, especialmente en pacientes con títulos negativos de anticuerpos neutralizantes.

Agradecimiento: Al Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología Francisco José de Caldas (COLCIENCIAS) por el apoyo financiero para la presente revisión (Proyecto código 656671250485, FP44842-307-2016).

Conflicto de intereses: Ninguno para declarar

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