Afectación de parámetros inmunológicos en un caso de leishmaniasis visceral autóctono del Noroeste Argentino

La leishmaniasis visceral (LV) presenta un espectro clínico variable, que va desde infección asintomática hasta enfermedad clínica con desenlace fatal y es considerada la parasitosis con mayor mortalidad, después de malaria ¹. En el Noroeste de Argentina, la leishmaniasis tegumentaria americana es endémica, pero hasta hace cerca de una década no se había registrado ningún caso de leishmaniasis visceral. Desde 2008 hasta la actualidad, se ha confirmado la presencia de siete casos humanos ², por lo que el posible avance de la LV en esta área geográfica actualmente representa un signo de alarma y motivo de preocupación para los sistemas de salud y para la comunidad. Nuestro grupo diagnosticó y documentó uno de estos casos humanos, causado por Leishmania (Leishmania) infantum en un paciente adulto ³.
El presente trabajo tiene como objetivo, valiéndonos de muestras de archivo del caso mencionado, determinar la afectación de distintos componentes del sistema inmune en etapas graves de la infección y analizar si la mejoría clínica se asocia a signos de una posible reconstitución inmune. Para esto, realizamos la determinación plasmática de citoquinas ya examinadas por otros grupos como parámetros inmunológicos asociados a enfermedad activa y curación ^{4, 5}, así como de otros parámetros plasmáticos relativos a inmunidad humoral. Por otra parte, analizamos el fenotipo de diferenciación y memoria de linfocitos T y B periféricos, antes de la administración del tratamiento, y luego de lograr la recuperación clínica.

Caso clínico

El paciente (varón, 44 años) presentaba deterioro progresivo del estado general de más de tres semanas, con fiebre, esplenomegalia y pérdida de peso. El diagnóstico de LV se determinó por el hallazgo de abundantes amastigotes en improntas de punción de médula ósea y la identificación de la especie responsable como L. (L.) infantum mediante secuenciación del gen citocromo b3. Se descartó infección por HIV, VHC y VHB. Se determinó pancitopenia pronunciada (glóbulos blancos, 1000/mm3; linfocitos, 530/mm3). Se recolectaron muestras de sangre periférica en ese punto y tres meses después de la administración de anfotericina B liposomal (3 mg/día, 7 días), momento en que se logró la recuperación clínica. Se guardaron alícuotas de plasma a -80 °C para ensayos de ELISA comercial de: interleuquina 10 (IL-10), interferón gamma (IFN-γ), factor activador de células B (BAFF), e inmunoglobulina G (IgG). Las células mononucleares periféricas criopreservadas a -140 °C se descongelaron para su análisis por citometría de flujo. Las mismas condiciones fueron aplicadas para un grupo control (GC, n = 12-16, resultados expresados en media ± DS), compuesto por sujetos sanos. Se obtuvo consentimiento informado escrito del paciente y se siguieron los principios enunciados en la Declaración de Helsinki.
En la etapa grave de la enfermedad, determinamos niveles plasmáticos aumentados de IFN-γ, IL-10 e IgG junto con concentraciones marcadamente elevadas de BAFF en comparación con el GC, parámetros que se normalizaron luego de alcanzar la recuperación clínica (Tabla 1).
En el momento crítico de la infección observamos una relación T CD4/CD8 invertida, de 0.17, que aumentó a 0.83 luego de la recuperación clínica. Tomando en cuenta trabajos previos que indican que, durante infecciones crónicas, células T de diferenciación temprana y de memoria central confieren mejor inmunidad protectora que células altamente diferenciadas y efectoras terminales (asociadas a senescencia y agotamiento celular) ^6-8 investigamos la evolución de la diferenciación y memoria T en el paciente. Definimos el perfil de diferenciación de células T según la co-expresión de los receptores CD27 y CD28 como células de diferenciación temprana (CD27+CD28+); de diferenciación intermedia (CD27-CD28+/CD27+CD28-) y de diferenciación tardía (CD27-CD28-). El paciente con LV demostró un aumento de células T de diferenciación tardía, especialmente en la subpoblación T CD8+, que se mantuvo luego de la recuperación clínica (Fig. 1d). La subpoblación T CD4+ sufrió cambios menores, con predominio de células de diferenciación temprana tanto antes como después del tratamiento (Fig. 1b). La diferenciación terminal de las células T CD8+ se apoyó también en un aumento en la expresión del marcador de senescencia CD57 (pre-tratamiento, 69.1%; post-tratamiento, 68.3%; GC, 18.3 ± 14.9%) y de la molécula perforina (pre-tratamiento, 36.7%; post-tratamiento, 40.4%; GC, 17.9 ± 12.8%). Para analizar el fenotipo de memoria de los linfocitos T, clasificamos a las células como vírgenes (naïve, CD27+CD45RO-), de memoria central (CD27+CD45RO+), de memoria efectora (CD27-CD45RO+) y efectoras terminales (CD27-CD45RO-).
En la Figura 1 se grafican células T CD4+ (Fig. 1a) y CD8+ (Fig. 1c) del paciente pre- y post- tratamiento, junto con los hallazgos en un sujeto sano, (análisis extensivos de células T de sujetos sanos, concordantes con este ejemplo fueron informados previamente por el grupo ⁶). En la etapa grave de LV, el perfil de memoria T CD4+ estaba compuesto principalmente por células naïve y células de memoria efectora; mientras que en los linfocitos T CD8+ predominaban células de memoria efectora y efectoras terminales. Estos resultados, preferentemente sobre linfocitos T CD8+, apuntan a la predominancia de un fenotipo de memoria avanzado. A pesar de que el fenotipo maduro persiste luego de la recuperación, en esta etapa también se observa un claro aumento de células T de memoria central para ambas subpoblaciones.
Por último, analizamos el perfil de memoria de los linfocitos B CD19+, caracterizamos las células como vírgenes (naïve, CD27-IgD+); de memoria sin cambio de isotipo (CD27+IgD+); de memoria clásicas (CD27+IgD-) y doble negativas (CD27-IgD-) (Fig. 1e). Encontramos predominancia de células B CD19+ naïve pre- y post-tratamiento, en concordancia con resultados obtenidos en el GC (62.2± 11.6%). No obstante, en la Figura 1e se muestra un porcentaje aumentado de células B doble negativas en la etapa grave de LV en contraste con valores hallados en GC (6.9± 2.3%), subpoblación que disminuye a valores cercanos a los del GC luego de la recuperación clínica.

Discusión

En este trabajo describimos características inmunológicas de un paciente con LV del interior de Salta, zona geográfica que desde hace algunos años está sufriendo el avance de esta enfermedad. Nuestra intención fue evaluar el efecto de la infección en componentes del sistema inmune, por lo que comenzamos nuestro estudio analizando niveles plasmáticos de IFN-γ e IL-10, que aumentaron en la etapa crítica y disminuyeron luego de la recuperación, en concordancia con estudios previos ^{4, 5}, enfatizando su relación con la evolución clínica. La relación CD4/CD8 disminuida ilustra el fuerte efecto producido sobre el sistema inmune y su aumento acompañando la recuperación clínica sugiere una mejoría a nivel inmunológico. Este hallazgo también fue encontrado por Hailu et al ⁹ en LV causada por L. donovani. La inversión de la relación CD4/CD8 también se asocia a un aumento de marcadores de senescencia y de agotamiento celular en infecciones como HIV ¹⁰. En concordancia, encontramos un perfil altamente diferenciado, preferentemente analizando linfocitos T CD8+ y enfermedad activa. Recientemente demostramos que los pacientes con leishmaniasis mucosa, forma grave de la leishmaniasis tegumentaria, presentan un perfil altamente diferenciado de células T⁶, fenotipo que también se asoció a infecciones virales y parasíticas crónicas, como consecuencia de la activación inmune persistente por el antígeno ^{7, 8}. En el presente caso, con menor cronicidad, sugerimos que el antígeno es capaz de gatillar una rápida activación inmune. Por consiguiente, otros factores como la carga parasitaria y características de la cepa infectante podrían modular también el grado de diferenciación de células T. La recuperación clínica se acompañó por un claro aumento de células T CD4+ y CD8+ de memoria central. El aumento de esta subpoblación luego de la terapia fue descrito en la infección por L. donovani ⁹ y la presencia de células T de memoria central se correlacionó con cargas virales disminuidas en la infección por HIV ¹¹.
Los linfocitos B también sufren algunos cambios durante la infección por L. (L.) infantum, como la expansión de células B doble negativas CD27-IgD- en la etapa clínica crítica. La población de memoria CD27- fue observada asociada a signos de agotamiento celular en malaria e infección por HIV ^{12, 13}; en nuestro trabajo, se requeriría realizar un estudio más exhaustivo de dicha subpoblación B para definir que se trate de células de memoria y para determinar una posible asociación con signos de agotamiento.
Además, en consonancia con el estudio de Goto et al ¹⁴, relativo a LV causada por L. donovani, encontramos una concentración plasmática de BAFF marcadamente elevada, junto con aumento de IgG, parámetros que se normalizaron luego de la recuperación clínica. BAFF es un regulador crítico de selección y sobrevida de células B periféricas, que se encuentra muy aumentado en enfermedades autoinmunes y fue asociado también a gravedad y actividad clínica en malaria ¹⁵.
Documentamos el compromiso global de parámetros inmunológicos en la etapa grave de la infección por L. (L.) infantum en un paciente adulto. Determinamos un profundo efecto del antígeno sobre el compartimiento de células T periféricas junto con cambios sutiles en subpoblaciones B de memoria, parámetros que tienden a revertir luego de la recuperación clínica, sugiriendo posibles signos de reconstitución inmune. Nuestros resultados permiten conjeturar que los parámetros evaluados podrían ser útiles como indicadores asociados a la evolución clínica de la LV.

Agradecimientos: Agradecemos al Servicio de Enfermedades Infecciosas Hospital Señor del Milagro, Salta, Argentina, en especial a la Dra. Noemí Dávalo por su colaboración durante la fase clínica del estudio; al Dr. Jorge Diego Marco y al Dr. Alberto Gentile por su participación en el trabajo de campo.

Conflicto de intereses: Ninguno para declarar

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